马铃薯病毒检测

试剂盒（SRA）

DAS-ELISA，碱性磷酸酶标记物

（请仔细阅读英文说明书，中文说明书仅供参考）         所有试剂及微孔板使用前均需回温到25℃左右

1.  试剂盒内组分

注意：以上试剂需要在4℃环境下保存。

注意：微孔板可在常温下保存。

2.  操作者应该注意之事项

----按推荐的温度贮存试剂以确保其活性

----不要长期贮存1倍浓度的缓冲液

----应避免试剂直接接触眼睛或皮肤，如不慎接触到试剂，请立即清洗或到医院就诊

----实验前后请务必洗手

3.  实验过程

3.1 准备工作

----实验前将抗体包被在微孔板上

----根据抗体标签上标识的稀释倍数，用1倍的包被缓冲液稀释抗体。混合均匀

----请根据使用量来确定抗体稀释液体积

注意：1个反应孔需要100ul的抗体稀释液。1ml的抗体稀释液足够8个反应孔使用，10ml的抗体稀释液够96个反应孔使用。

在聚乙烯材质的容器中制备抗体溶液。（避免抗体黏附的容器上）。抗体溶液准备好后需立即包被，否则抗体可能会部分失效。

抗体稀释液不能存放，配制好后请立即使用。

3.1.1包被抗体

----在每个反应孔中加入100ul抗体稀释液

3.1.2孵育

----在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育4小时或在4℃条件下过夜

3.1.3洗板

----孵育结束后，将反应孔中的试剂倒出

----加入250ul的1倍PBST缓冲液，之后快速倒出，重复4-8次

----将微孔板倒扣在吸水纸上以控干孔中残留液体

3.2 样品的提取及稀释

3.2.1样品的提取

----尽可能选择出现症状的植物组织作为样品，通常将叶片作为ELISA实验的检测样品，其它植物组织也可用于ELISA实验

----在1个反应孔中加入多片叶片的提取液会使实验更经济一些，但却降低了实验的灵敏度。如对样品提取有任何疑义请与本公司联系

----若用研钵提取样品，在每份样品提取后请彻底清洗研钵，以免造成样品间的相互污染

----绝大多数样品，可使用通用样品提取缓冲液。但有些植物（葡萄、蓝莓等）必须使用特殊的提取缓冲液。如对样品提取缓冲液有任何疑义请与本公司联系

3.2.2样品的稀释

----样品研磨后，将样品提取液与提取缓冲液以1：10（样品提取液体积：提取缓冲液体积）的比例混合均匀。或以1：10（样品质量：提取缓冲液体积）的比例在提取缓冲液中研磨样品

----每个反应孔需要100ul的样品提取稀释液。多准备一些样品提取稀释液以利于吸取

3.3 点样及孵育

3.3.1点样

----根据实验设计图表，取100ul样品提取稀释液到各样品孔中

----取100ul样品提取缓冲液到缓冲液对照孔中

3.3.2孵育

----在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育2小时或4℃条件下过夜

3.4  酶标记物的制备

----将ECI缓冲液稀释到1倍

----根据酶标记物标签上的稀释倍数将酶标记物加到1倍ECI缓冲液中，混合均匀

----根据使用量来确定酶标记物稀释液的体积

注意：1ml的酶标记物稀释液足够8个反应孔使用，10ml的酶标记物稀释液够96个反应孔使用。

酶标记物请在孵板结束前的10分钟内制备完成。

制备过程请使用清洁的、未使用过的移液管。

3.5  洗板、加酶标记物稀释液及孵育

3.5.1洗板

----步骤同上

3.5.2加酶标记物稀释液

----在各反应孔中加入100ul酶标记物稀释液

3.5.3孵育

----在恒湿箱中，室温下（25℃）孵育2小时

3.6 PNP底物的制备

孵育结束前的15分钟制备PNP底物溶液。在室温下用5ml PNP缓冲液（1倍浓度）溶解1片PNP底物片。每片PNP底物片可溶解成5ml的底物溶液，溶解比例为1mg/ml，大约够40个反应孔使用。

注意：请勿直接接触PNP底物片或将底物溶液暴露在强光下，直接接触或强光刺激会在阴性反应孔中导致背景色干扰。

3.7  洗板、加PNP底物溶液及孵育

3.7.1洗板

----步骤同上

3.7.2加PNP底物溶液

----在各反应孔中加入100 ul PNP底物溶液

3.7.3孵育

----在恒湿箱中孵育30-60分钟

3.8  终止反应

----孵育结束后，在各反应孔中加入50ul 3M的NaOH终止反应。这一步可以选做

4.  结果

直接用肉眼观察或用酶标仪在405nm波长下测量结果

阳性结果：微孔中有明显颜色变化

阴性结果：微孔中没有明显颜色变化

注意：只有在阳性质控孔得到阳性结果的时候，实验结果才是可靠的。结果可保持1小时左右。（只要阴性质控孔不发生颜色变化）。

附： 缓冲液的制备

1.  制备PBST缓冲溶液

用蒸馏水将试剂盒提供的PBST浓缩液稀释成1倍 PBST。1倍 PBST的缓冲液只能保存1天。

2.  缓冲液干粉

样品提取缓冲液可直接用缓冲液干粉来配置。

注意：每次实验只制备当天测定所需量的样品提取缓冲液。

3.  缓冲液组成成分（试剂盒中提供，提供成分以供参考）

3.1通用样品提取缓冲液组成成分

用1000ml 1倍的PBST溶解以下物质

注意：调整pH值到7.4，4℃下贮存。

3.2越橘（蓝莓）类样品提取缓冲液组成成分

用1000ml通用样品提取缓冲液溶解以下物质

注意：4℃下贮存。

3.3葡萄样品提取缓冲液组成成分

用900ml 蒸馏水稀释以下物质

注意：用盐酸调整pH值到8.2，再用蒸馏水定容到1000ml。

4℃下贮存。

3.4包被缓冲液组成成分

用1000ml蒸馏水稀释以下物质

注意：调节PH值到9.6，4℃下贮存。

3.5 PBST缓冲液（洗涤缓冲液）组成成分

用1000ml蒸馏水稀释以下物质

注意：调整pH值到7.4。

3.6 ECI缓冲溶液

用1000ml 1倍 PBST稀释以下物质

注意：调整pH到7.4，4℃下保存。

3.7 PNP缓冲液

用800ml蒸馏水稀释以下物质

注意：用盐酸将pH值调为9.8，再用蒸馏水定容到1000ml。

4°C下贮存。