黄曲霉毒素M1检测试剂盒（酶免）

德国拜发 R-Biopharm ELISA KITS试剂盒  酶联免疫法定量检测黄曲霉毒素 M1

RIDASCREEN®  Aflatoxin M1 30/15

体外诊断试剂

储存温度 2 - 8 °C

产品咨询联系电话：020-82569399

产品简介

RIDASCREEN®  Aflatoxin M1 30/15黄曲霉毒素 M1 检测试剂盒，采用竞争性酶联免疫法定量测定奶类、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素 M1 的含量。

试剂盒中含有酶联免疫检测所需的所有试剂，包括标准品。

试剂盒足够进行96次检测（包括标准测定）。

定量分析需要使用微孔板酶标仪。

样品处理： 

奶类样品：脱脂

         奶粉样品：溶解，脱脂

         奶酪样品：提取，离心

检测时间：  样品制备（以10个样品为例）

  奶类和奶粉样品 ...........................................约 0.5小时

  奶酪样品.........................................................约 2小时

  检测过程（孵育时间）.........................................1小时

检测限：  奶类样品：.............................................................5 ppt

  奶粉样品（相对于溶解后的液态样品）：..............5 ppt

  奶粉样品（相对于溶解前的粉制样品）：............50 ppt

  奶酪样品：.......................................................... 50 ppt

回收率：  在人工添加的全脂奶样品中

  （10 - 80 ppt）：..............................................约95 % 

  （变异系数：约14 %）

  奶粉样品：........................................................约95 %

  奶酪样品：.....................................................  约102 % 

  （变异系数约11 %）

特异性： RIDASCREEN®  Aflatoxin M1 30/15 黄曲霉毒素 M1 检测

试剂盒的特异性根据与相关霉菌毒素的交叉反应确定。 

  黄曲霉毒素 M1 .................................................... 100 %

  黄曲霉毒素 M2 ...................................................... 30 %

1. 用途

RIDASCREEN®  Aflatoxin M1 30/15黄曲霉毒素 M1 检测试剂盒，采用竞争性酶联免疫法定量测定奶类、奶粉和奶酪中的黄曲霉毒素 M1 的含量。

2. 概要

黄曲霉毒素是由霉菌 Aspergillus flavus 及 Aspergillus parasiticus 产生的致癌的高毒性代谢产物。黄曲霉毒素 M1，即所谓的牛奶黄曲霉毒素是黄曲霉毒素 B1 的代谢产物，它隐藏于由食用了含黄曲霉毒素 B1 的饲料的奶牛所产的牛奶中。 

黄曲霉毒素 M1 能在常规的巴氏法消毒后继续存活，故其是生产原材料样品和成品的必检项目。 

1999年 1月起欧盟范围内规定了黄曲霉毒素残留限量。其中黄曲霉毒素 M1 的残留限量值为 0.05 µg/l (50 ppt)。

3. 检测原理

检测的基础是抗原抗体反应。微孔板包被有特殊的黄曲霉毒素 M1 抗体。加入标准品或样品溶液和在洗涤步骤后加入的酶标记黄曲霉毒素 M1 （酶连接物）。游离的黄曲霉毒素 M1 和酶连接物竞争抗体结合位点（竞争性酶联免疫分析）。没有结合的酶连接物在洗涤步骤中被除去。

在孔中加入底物/发色剂，结合的酶连接物将发色剂转化为蓝色。加入反应终止液后颜色由蓝色转变为黄色。在 450 nm处测量，吸光度值与样品中的黄曲霉毒素 M1 浓度成反比。

4. 试剂盒组份

每一个盒中的试剂足够进行 96次检测（包括标准测定）。盒中的组份如下：

1 x 96孔微孔板（12条每条8孔）

  包被有针对黄曲霉毒素 M1 的抗体

6 x 标准品（每瓶1.3 ml）

 0 ppt（零标准品），5 ppt， 10 ppt， 20 ppt， 40 ppt， 80 ppt 

  含有黄曲霉毒素 M1 的奶缓冲液

1 x 酶连接物（1.3 ml）..........................................................................红色瓶盖

  过氧化物酶标记的黄曲霉毒素 M1

  浓缩液

1 x 底物/发色剂（10 ml）................................棕色瓶盖红色，含有四甲基联苯胺

1 x 反应终止液（14 ml）..................................

  含1 N 的硫酸

1 x 缓冲液1（20 ml）

  样品稀释缓冲液

1 x 缓冲液2（12 ml）............................................................................白色瓶盖

  酶连接物稀释缓冲液

1 x 洗涤缓冲液（盐）

  用于制作 10 mM 的磷酸缓冲液，pH 7.4

  含有0.05 % Tween 20

5.另需的试剂和设备

5.1. 设备：

− 微孔板酶标仪（450 nm）

− 离心机

− 巴氏吸液管

− 刻度移液管

− 可调式20 µl - 200 µl 和 200 - 1000 µl 微量移液管

− 仅用于奶酪样品

− 振荡器

− 蒸发器

5.2. 试剂：

− 仅用于奶酪样品

− 甲醇

− n  - 庚烷

− 二氯甲烷

− PBS  - 缓冲液，pH 7.2：0.55 g NaH2PO4 x H2O + 2.85 g Na2HPO4 x 2 H2O + 9

g NaCl，加蒸馏水至1000 ml

6. 操作者应该注意之事项

标准品中含有黄曲霉毒素 M1，应特别小心。避免皮肤接触（使用手套）。

玻璃器具和有毒溶液用次氯酸钠溶液（10 % （v/v））浸泡消毒过夜（用 HCl 调节

溶液 PH 值为7） 。

反应终止液为1 N 硫酸（R36/38， S2-26）。

7. 储存条件

保存试剂盒于 2 - 8 °C，不要冷冻。

将不用的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封储存于 2 - 8 °C条件下。

黄曲霉毒素对光敏感，因此标准品要避免直接暴露在光线下。

底物/发色剂对光敏感，因此要避免直接暴露在光线下。

对过了有效期（见试剂盒标签）的试剂盒不再提供任何质量保证。

不能交叉使用不同批号的盒中试剂。

8. 试剂变质的迹象

− 红色的底物/发色剂在使用前发现颜色变蓝

− 零标准品的吸光度值小于0.6 （E450 nm < 0.6）

9. 样品处理

样品应当冷藏保存。

9.1.奶类样品

−用冷冻离心机在10 min / 3500 g / 10 °C 条件下去除脂肪（如果没有冷冻离心机，必须在离心前将样品冷却到 10 °C）

  −离心后可用巴氏吸液管彻底去除表面的奶油

  −取脱脂牛奶用于检测（每孔 100 μl）  （稀释倍数1）

 直接处理方法

 −取牛奶20ul 和180ul 缓冲液1混合（1： 10 的比例稀释），每孔取100 µl 进行检测（稀释倍数10）

9.2. 奶粉样品

 −称取10 g 奶粉样品于烧杯中，加入去离子水至 100 ml

−搅拌5分钟使其充分溶解

−然后按奶类样品进行处理（参见 9.1）

9.3. 奶酪样品

对采集的代表性样品进行粉碎和混合，不要加入任何液体。对于表面长有霉菌的样品去掉表面，因为其会影响检测结果。

− 称取 2 g 粉碎后的奶酪样品于可密闭的玻璃容器中

− 加入 40 ml 二氯甲烷搅拌或者振荡15分钟提取

− 滤去悬浮物，取10 ml 滤液蒸干（微弱氮气流中，60 °C）

− 油状残留物用 0.5 ml 甲醇、0.5 ml PBS缓冲液（参见 5.2.）和1 ml 庚烷溶解、充分混合

− 离心：15 min / 2700 g / 15 °C

− 完全去除上层庚烷层

− 用巴氏吸液管小心吸出下层的部分甲醇-水溶液

− 其中的100 µl和400 µl缓冲液1混合（1：5的比例稀释），每孔取100 µl 进行检测

备注：

如果还需要继续进行稀释，使用缓冲液 1（参见 4）

10. 检测步骤

10.1. 检测前的准备

使用之前将所有试剂回温至室温（20 - 25 °C）。

黄曲霉毒素M1酶连接物（红色瓶盖的瓶子）为浓缩液。因为稀释的酶连接物的弱稳定性，所以应严格根据用量用缓冲液 2 进行稀释。在使用酶连接物前要仔细地轻轻振摇。用缓冲液 2（白色瓶盖瓶子）对酶连接物浓缩液按照 1:11（1+10）的比例进行稀释。（比如：400 µl 浓缩液+ 4 ml 缓冲液，足够进行4条微孔板条的检测）。

洗涤缓冲液是 PBS-Tween 缓冲液，为此试剂盒中提供了一袋洗涤缓冲液盐（参见4.）。使用1 l 蒸馏水溶解一袋洗涤缓冲液盐制得洗涤缓冲液。制备好的洗涤缓冲液可在2 - 8 °C下保存大约 4 - 6周时间。

或者：  用100 ml蒸馏水溶解袋中的洗涤缓冲液盐，得到10倍的洗涤缓冲液盐浓缩液，此溶液能在室温（20 - 25 °C）下储存 8 - 12周。使用时，用9份蒸馏水溶解 1份此浓缩液得到洗涤缓冲液。

10.2. 检测操作

仔细进行洗板的操作非常重要。在使用中不要让微孔出现干燥。

1. 将足够标准品和样品检测所需数量的孔条插入微孔板架。记录标准品和样品的位置。

2. 将100 µl 标准品或者按照步骤9处理后的样品加入相应的微孔中，均做两个平行实验。充分混合后，在室温下（20 - 25 °C）暗处孵育30分钟。

3. 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打 3 次）以保证完全除去孔中的液体。加入 250  μl 洗涤缓冲液（参见 10.1.）洗涤，上述操作重复进行两遍。

4. 然后向对应的微孔中加入 100 µl 稀释后的酶连接物溶液，小心用手震荡混合后在室温下（20 - 25 °C）避光孵育15分钟。

5. 倒出孔中的液体，将微孔板架倒置在吸水纸上拍打（每轮拍打 3 次）以保证完全除去孔中的液体。加入 250  μl 洗涤缓冲液（参见 10.1.）洗涤，上述操作重复进行两遍。

6. 向每一个微孔中加入 100  μl 底物/发色剂（棕色瓶盖），充分混合后在室温下（20 - 25 °C）暗处孵育15分钟。

7. 向每一个微孔中加入 100  μl 反应终止液（黄色瓶盖），充分混合。在加入反应终止液后 15分钟内于450 nm处测量吸光度值。

11. 结果评估

请使用R-Biopharm德国拜发公司专门为RIDASCREEN® 系列产品设计的应用软件

RIDA® SOFT Win（订货号：Z9999）来进行结果分析。

关于标准曲线请参看试剂盒中附带的质保证书。 

以下是没有使用软件的计算方法：

标准品的吸光度值（或样品）

-----------------------------             x 100   =   % 吸光度比值

零标准品的吸光度值

吸光度值以百分比表示，因此零标准品等同于 100 %。计算标准品相应的比值，并绘成一个与黄曲霉毒素M1 [ng/l] 相关的半对数坐标系统的曲线图。

为了真实反映黄曲霉毒素M1的浓度，从校正曲线上读出的浓度值必须乘以相对应样品的稀释倍数。按照说明书中给出的方法进行操作，可得到以下样品稀释倍数：

奶类样品...........................................................................   1

  奶粉样品（相对于溶解后的液态样品） ............................   1

  奶粉样品（相对于溶解前的粉制样品） ............................   10

  奶粉样品.......................................................10

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