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使用说明书
【药品名称】
人乳头瘤病毒核酸扩增荧光检测试剂盒
【英文名】
PCR Fluorescence Detection Kit for Human Papillomavirus
【汉语拼音】
Ren Rutouliu Bingdu(HPV) Hesuankuozeng(PCR) Yingguang Jiance Shijihe
【正文】
【用途】本试剂盒适用于HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)感染的辅助诊断。
【试验原理】本试剂盒采用多重核酸扩增(PCR)荧光检测法，根据高危型人乳头瘤病毒(HPV)的L1基因靶序列设计高度特异的引物和探针，能在同一PCR反应中检测宫颈口脱落细胞中的13种高危型HPV(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)的脱氧核糖核酸(DNA)。
【主要组成成份】
| 组份 | 规格(40μl体系)* | 规格(25μl体系)** |
| 核酸扩增试剂 | ||
| HPV PCR反应液 | 1.5ml/管×1 | 910μl/管×1 |
| Taq酶 | 16μl/管×1 | 8 μl/管×1 |
| UNG | 4 μl/管×1 | 2 μl/管×1 |
| 样本处理试剂 | ||
| DNA提取液 | 1 ml/管×2 | 1 ml/管×2 |
| 对照品 | ||
| 阴性对照 | 15μl/管×1 | 15 μl/管×1 |
| 临界阳性对照 | 15μl/管×1 | 15 μl/管×1 |
| 强阳性对照 | 15μl/管×1 | 15 μl/管×1 |
*注:40μl体系适用于ABI 7000、7500、7700，PE5700，MJ Research Opticon2，BIORAD iCycler等荧光PCR扩增检测仪。
**注:25μl体系适用于ROCHE LightCycler荧光PCR扩增检测仪。
【适用仪器】
适用于ABI 7000、7500、7700，PE5700，MJ Research Opticon2，BIORAD iCycler及ROCHE LightCycler荧光PCR扩增检测仪。
【样本要求】
标本类型
妇女宫颈口脱落细胞。
采样方法
采样前，用生理盐水浸湿的棉拭子轻轻拭净宫颈口过多的分泌物，更换棉拭子(用生理盐水浸湿)，在宫颈管内鳞柱上皮交界处采样，采样时注意稍用力转动两周，取得宫颈脱落细胞。迅速将采样拭子浸入盛有1ml无菌生理盐水的样本管中，充分漂洗。将棉拭子贴壁挤干后丢弃，标本立即送检。
标本保存
采集的标本应尽快送检，建议4℃保存不超过24小时，－20℃保存不超过6个月,需要长期保存的标本应置于－70℃保存，避免多次冻融标本。
【试验方法】
1样本处理
1.1标本预处理
进行DNA提取之前，将所有标本置13,000rpm离心5分钟，保留沉淀物。(注意:解冻－20℃保存的标本需在室温条件下进行！)
1.2DNA提取
1.2.1准备三个离心管，分别加入阴性对照、临界阳性对照和强阳性对照各5μl。
1.2.2分别向标本沉淀物及上述对照品管中加入50μl DNA提取液，振荡混匀；沸水浴(或干浴)10分钟。
1.2.313,000rpm离心10分钟，样本上清液可直接用于PCR检测。
1.3DNA样品保存
建议DNA样品立即用于PCR检测，否则4℃保存；当天不检测的样品，－20℃保存。
2反应液配制
对ROCHE LightCycler,按25μl体系配制PCR反应混合液，每个反应管分别取HPV PCR反应液22.75μl、Taq酶0.2μl、UNG 0.05μl配制反应混合液；对其它类型仪器,每个反应管按40μl体系配制PCR反应混合液，分别取HPV PCR反应液37.5μl、Taq酶0.4μl、UNG 0.1μl配制反应混合液；反应管总数为标本数与对照品数之和。
将反应混合液充分混匀并短暂离心后，再分装至各PCR反应管中；最后转移反应管至检测区。
3加样
向每个反应管反应液中加入2μl待测DNA样品。盖紧管盖、混匀、离心后置于PCR检测仪上扩增检测。
(注意:－20℃保存的DNA样品，应在加样前取出，置室温自然解冻，然后13,000rpm离心1分钟，取上清用于检测！)
4PCR扩增检测
按以下条件设置扩增和检测参数，不同仪器的设置方法参照各仪器使用说明。
4.1荧光检测参数设置
设置能收集FAM荧光信号的荧光检测通道。
4.2PCR扩增参数设置
表1不同仪器的扩增参数设置
| 适用仪器类型 | ABI7000、7500、7700，PE5700, BIORAD iCycler, MJ Research Opticon2等 | ROCHE LightCycler | |
| 扩增参数设置 | 1 50℃ 2min,1 cycle； | 1 50℃ 2min, 1 cycle； | |
| 2 95℃ 10min,1 cycle； | 2 94℃ 10min, 1 cycle； | ||
| 3 95℃ 15 sec, 52℃ 30 sec, 62℃ 1 min, 40* cycles | 3 93℃ 10 sec, 52℃ 30 sec, 62℃ 40 sec, 40 cycles | ||
*注:对BIORAD iCycler设为42。
【对试验结果的解释】
1参数设定
基线(baseline)设定方法:一般情况下取按如下方式设置基线，比如:对ABI 7000、7500、7700等仪器，基线范围为6-15循环，PE5700为3-15个循环，MJ Research Opticon2的基线范围为6-12个循环，对ROCHE LightCycler，基线调整方式设置为“Arithmetic”。特殊情况下也可对基线作适当调整。
阈值(threshold)设定原则:使刚好超过阴性扩增曲线的最高值。
2质量控制
质控品检测结果必须符合下述条件:
a*阴性对照无扩增。
b临界阳性对照的CT值在30＜CT≤36范围内。
c强阳性对照的CT值在24＜CT≤30范围内。
如有一项条件不符,则本次实验无效。
*注:对无扩增的阴性对照，不同仪器显示结果有差异:ABI 7000 显示为“undet”，ROCHE LightCycler无数值显示，PE5700及ABI 7700等仪器则显示为PCR扩增最大循环数。
3结果判断
设置了基线和阈值后,仪器会给出各样本的相应CT值,一般情况下根据CT值即可进行结果判断。为防止出现误判，建议分析有CT值样本的扩增曲线，如果扩增曲线为非“S型”，则应作为特例按阴性结果报告，不能仅凭CT值作为结果判断的依据。
根据CT值进行结果判断的标准如下:
aCT值小于37的样本，报告为高危型HPV阳性。
b无CT值或CT值为40*的样本，报告为高危型HPV阴性。
cCT值在37～40之间的样本，建议重做；如果重新检测CT值小于40，报告为高危型HPV阳性，否则报告为高危型HPV阴性。
*注:对BIORAD iCycler，阴性样本CT值显示为42。
【该试验方法的局限性】
本试剂盒使用一种荧光信号(FAM)检测13种HPV型(HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68)，不具体区分HPV型别，但是不影响临床使用中对HPV感染的辅助诊断。
【产品性能指标】
本试剂盒对HPV16、18、45、58等4个HPV型重组质粒的最低检出限为5′102拷贝/微升，对HPV31、33、35、39、51、52、56等7个HPV型最低检出限为1′103拷贝/微升，对HPV59和HPV68的最低检出限为1′104拷贝/微升。
【注意事项】
1本试剂盒仅用于体外检测。
2所有操作须严格按说明书进行。
3使用前将试剂盒内试剂置室温自然解冻，混匀后使用。
4样本采集保存和运输必须遵守国家相关法规。
5实验室管理严格按国家相关临床基因扩增检验实验室管理规范执行。实验室实行分区管理，分为前准备区、样本处理区和检测区。各区配备专用设备和物品，不可交叉使用。
6使用一次性吸头，一次性手套和各区专用工作服。
【生产企业】 广州健仑生物科技有限公司
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