线粒体蛋白提取试剂盒，国产现货，质量同比pierce

一、     试剂盒说明

toscience线粒体蛋白提取试剂盒首先从动物细胞或组织中分离出完整而纯化的线粒体，然后用含有蛋白酶抑制剂及磷酸酶抑制剂的裂解缓冲液Lysis Buffer裂解线粒体得到纯度高的线粒体蛋白。适合于动物软组织（肝或脑组织）和硬组织（肌肉）以及培养细胞的线粒体蛋白的制备。其中线粒体的分离原理基本上采用：第一，通过机械方法破裂细胞；第二，通过低速差速离心去除残渣碎屑和巨大细胞器；第三，通过高速差速离心获得线粒体。获得的线粒体蛋白可用于Western Blot、免疫共沉淀等后续研究

二、     试剂盒组份

三、  操作步骤

    I  线粒体的提取

1. 样本处理

a. 组织匀浆：称取100~200 mg新鲜组织如肝脏、脑、心肌等，PBS或生理盐水冲洗，洗净血水，滤纸吸干，用剪刀剪为碎块放入小容量玻璃匀浆器内。加入1.5 mL冰预冷的Lysis Buffer1，lue="0" unitname="℃" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px;">0℃冰浴上下研磨组织20次；

b. 培养细胞匀浆：消化细胞，PBS洗涤，800 × g 5~10 min离心收集细胞。计数。每次提取需要5 × 10⁷个细胞，加入1.5 mL冰预冷的Lysis Buffer1重悬细胞，将细胞悬液转移到小容量玻璃匀浆器内，lue="0" unitname="℃" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px;">0℃~lue="4" unitname="℃" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px;">4℃冰浴用间隙严密的研杵研磨细胞30~40次；

2. 将组织或细胞匀浆物转移到离心管，4 ºC， 800 × g 离心5 min。细胞核、大的膜碎片、未裂解细胞等在管底；

3. 在另一个新的预冷的离心管中预先加入0.5mL Medium Buffer，将匀浆后的上清液0.5mL（Medium Buffer：上清液体积=1：1）沿管壁小心地加入该离心管中，覆盖于Medium Buffer的上层。

4. 4 ºC， 15,000 × g 离心10 min。离心后的上清含胞浆成分，将上清转移到新离心管，线粒体沉淀在管底；

5. 在线粒体沉淀中加入0.2 mL  Wash Buffer重悬线粒体沉淀，4 ºC ，15,000 × g 离心10 min，弃上清；

II  蛋白的提取

1、  在每 mL冷 Lysis Buffer2加入5μL磷酸酶抑制剂， 1μL蛋白酶抑制剂和5μL  100mM PMSF，混匀。冰上保存数分钟待用。

2、  每20μL线粒体压积中，加入200μL上述配制好的冷Lysis Buffer2；

3、   置于lue="4" unitname="℃" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px;">4℃摇床平台上，温和振荡15 min；

4、   14,000rpm，lue="4" unitname="℃" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px;">4℃离心15min，取上清为全蛋白提取物, 蛋白定量（Bradford法、BCA法）；

5、  分装保存于lue="70" unitname="℃" style="margin: 0px; padding: 0px; border: 0px;">-70℃,避免反复冻融。

四、  注意事项

1．为保证获得完整的线粒体，第一是全程低温操作，将样品管放在冰水浴而不是碎冰块中。第二是快速。微量制备比大规模制备操作更方便和快速，因而更容易获得完整的线粒体。第三，在不破坏亚细胞器的情况下破碎细胞是制备线粒体的最关键环节。与组织块相比，培养细胞特别是贴壁培养细胞在用玻璃匀浆器匀浆时较难破壁，因而要选用小容量玻璃匀浆器、间隙严密的研杵上下研磨培养细胞。在相差显微镜下检查未裂解细胞应在50%左右即可。过度研磨将破坏线粒体，研磨不足将降低得率。

2. 以离心力g计算正确的离心速度，不同的离心机可据此精确计算离心速度。

3. 进行Western Blot和2D-胶电泳，可直接加入样品缓冲液裂解线粒体。

4．所有接触样品的用具及试剂均需预冷。