高保真平端PCR克隆试剂盒

高保真酶产生平端PCR产物，pEcoRV Vector是一种高效克隆保真酶PCR产物（平端产物）的专用载体。本载体在E.coli自杀基因ccdB（Control of cell death）的上游启动子内引入一个EcoRV位点。自连产物转化E.coli后，ccdB基因则会表达，ccdB基因的表达蛋白，会破坏细菌的DNA gyrase，造成细菌染色体的降解导致细菌死亡（阴性克隆）；载体插入外部片段的时候，破坏了ccdB的读码框，使载体能在E.coli中扩增（阳性克隆）。这样可以极大改善平端连接高背景的缺点，节省筛选的时间。

用途

• 高保真酶的PCR产物克隆
• 用于高保真酶PCR产物的测序（M13 primer）
• 普通平端PCR产物克隆

储存条件

冰袋运输；长期保存-20℃（12个月以上）；10 T4 DNA ligase Buffer 中含 ATP，为避免ATP的降解，建议解冻后的10 T4 DNA Ligase Buffer 分装成小包装并在-20℃保存。

产品特点

• pEcoRV自连产物转化大肠杆菌，大肠杆菌菌落<5个/10平板。
• pEcoRV载体和Control insert连接转化大肠杆菌，大肠杆菌菌落>100个/平板。

试剂盒组成

使用示例

1. 以 10μl 连接体系示例，在微量离心管中加入以下各种成分：

   试剂	使用量
   pEcoRV Vector（20ng/µl）	10ng
   Insert DNA	3:1 to 10:1 (molar ratio over vector)
   10 T4 DNA Ligase Buffer	1µl
   T4 DNA Ligase（10U/µL）	1µl
   ddH2O	Up to 10µl

2. 16℃反应30min；
   • 室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低
   • 保温5min也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低
   • PCR产物（2Kb以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时
3. 连接产物(10ul)加入100ul DH5a(或者Top10)感受态细胞中，冰中放置30min；
4. 42℃加热45秒后，再在冰中放置2min；
5. 加入500ul LB培养基，37℃培养30min；
6. 在含有Kan+的LB琼脂平板培养基上培养，37℃过夜，形成单菌落，计数；
7. 挑选菌落，用PCR方法确认插入片段的长度。

克隆结果示例

注意事项

• 连接酶：
  • T4 DNA连接酶要求Mg²⁺，因此螯合Mg²⁺的EDTA的存在会阻碍反应；
  • NaCl或KCl浓度大于200mM时强烈抑制T4 DNA Ligase；
  • 65℃孵育10分钟或70℃孵育5分钟可以导致T4 DNA Ligase失活；
  • 聚乙二醇(PEG) 极大地增加平末端连接效率。
• 插入片段：
  • 如果Insert DNA 太小（<100bp），不能够完全破坏ccdB的启动子，将造成筛选失败;
  • Insert DNA应该是KOD酶（货号K003）扩增（而非Taq酶）胶回收纯化处理后才进行载体连接，尽量避免其他杂带的存在;
  • PCR产物（2Kb以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长至数小时。
• 感受态细胞的选择：
  • 转化时请使用高效的热转化感受态细胞（转化效率≥1X108cfu/µg pUC19），这样才可能得到比较理想的阳性克隆。
• 克隆产品测序引物：M13 reverse primer, M13(-40) forward primer (见下图) pEcoRV Vector 载体结构图： 

包装规格