来自天津商业大学生物技术与食品科学学院的王泳，龚建苗，贾彦等人采用结肠癌细胞HT-29，经脂多糖（LPS）刺激干预后分别用免疫共沉淀法和线粒体膜电位法测定乳源CGMP对人结肠癌HT-29细胞NF-κB信号通路关键蛋白的影响，确定相应的作用靶点，更进一步地探讨并阐述乳源CGMP调控NF-κB信号途径，为确定乳源CGMP的抗炎分子机制以及维护相关肠黏膜内环境生物学活性功能提供科学依据，使乳源CGMP作为功能性食品用于炎症性肠病的生物免疫治疗奠定基础。
1
乳源CGMP对HT-29细胞NF-κB信号途径中调节蛋白NEMO的影响
表达载体的构建、表达和测序
通过测定260 nm波长处吸光度测定DNA的质量浓度分别为pCMV-Myc 401 ng/μL、pCMV-Flag 466 ng/μL，测序结果经过比对为正确序列。
质粒瞬时转染HT-29细胞
Myc-CGMP在20 h就有较高的表达量，而Flag-NEMO在20 h时表达量还比较少，随时间延长，Flag-NEMO表达量增大，28 h时表达量已经很高。
乳源CGMP与NEMO的相互作用
由结果中WB：Myc、WB：Flag可以看到pCMV-Myc-CGMP质粒和pCMV-Flag-NEMO质粒共转HT-29后，乳源CGMP与NEMO/IKKγ蛋白均表达，通过IP：Myc可以看到在过表达条件下乳源CGMP与NEMO/IKKγ有明显的相互作用，只是因为两者分子质量相差1 kD条带分开不明显，但可明显看到在lgG（L）表达量相差不大的情况下，两者共转后IP经Western blotting检测条带明显宽于其中任何一个单独转染，证明两者存在明显的相互作用。
2
乳源CGMP对HT-29细胞凋亡的影响
随着作用时间延长，各组线粒体膜电位均呈增加趋势；L组与N组相比线粒体膜电位均略低；相同孵育时间时，CGMP组随质量浓度的增加，线粒体膜电位均先增加后降低，在0.1 μg/mL时膜电位最大。
讨 论
基因毒性应力导致NEMO通过位点特异性SUMO-1 结合于NLS。 IκB的激活降解依赖IKK，所以，NEMO的SUMO化可以影响NF-κB信号途径的转录激活。细胞发生凋亡时，线粒体会发生一系列的变化：线粒体通透性增加，大量可溶性蛋白释放到胞浆（大多数可溶性蛋白带负电荷），使膜间隙的正离子不断进入基质，导致内膜两侧的离子梯度消失，从而使膜电位下降，因此用Rh123线粒体膜电位检测细胞凋亡。
结论
本实验利用免疫共沉淀技术验证了乳源CGMP可与NEMO相互作用，说明乳源CGMP可间接作用于IKK而作用于IκB，实现调控NF-κB信号途径的激活。研究阐述了乳源CGMP表现促进HT-29细胞凋亡的能力，而NF-κB信号途径抗细胞凋亡，这可能是乳源CGMP调控NF-κB信号途径的另一方式。进一步研究确定乳源CGMP具有显着的调节NF-κB信号途径，改善炎症性肠病引发的结直肠癌的作用。
