基于Cur在有机溶剂中的溶解特性，为了提高其包埋率，反溶剂法被广泛应用。但是反溶剂过程中消耗大量的有机试剂以及纯水，不符合现代食品工业环保绿色的生产原则。研究操作简便且绿色环保的物理方法制备大豆分离蛋白(SPI)-Cur纳米颗粒极具工业应用价值。
华南理工大学食品科学与工程学院的袁丹、赵谋明和张思锐等人以SPI为原料，在特定pH值条件下(pH 7.0、5.9)静态加热处理(95 ℃、30 min)诱导SPI自组装形成纳米颗粒，分别记作HSPI及HSPI(pH 5.9)，系统表征了它们的粒径、PDI、表面疏水性以及表观形貌，并利用荧光光谱研究它们与Cur的相互作用。通过均质或超声处理制备SPI-Cur纳米颗粒，探究蛋白-Cur纳米颗粒中Cur的水溶解度以及颗粒的性质和贮藏稳定性。
1 SPI纳米颗粒的形成与表征
1.1 颗粒粒径、分散性和表面疏水性
实验首先利用DLS探究了pH 7.0及pH 5.9条件下加热对蛋白粒径及PDI的影响。结果显示，SPI虽然平均粒径小(＜80 nm)，但是粒径分布不均匀(PDI＞0.5)。热作用使得SPI发生热变性形成聚集体，显着增加其平均粒径，但是同时增加其分散均一性。进一步通过ANS－法测定3 个蛋白样品的表面疏水性，结果表明，热处理可显着增加蛋白表面疏水性(P＜0.05)。其中，pH 5.9条件下加热蛋白可使巯基转变成二硫键，而二硫键的周围常聚集着疏水性氨基酸，这使得HSPI(pH 5.9)的表面疏水性最高。
1.2 形貌学
为了更好地了解SPI纳米颗粒以及比较SPI、HSPI和HSPI(pH 5.9)三者的差异，通过TEM观察其表观形貌，如图1所示。SPI表面光滑，大部分为近乎球形颗粒，其颗粒大小不一；HSPI表面粗糙,颗粒感减弱,有明显的聚集体出现；而HSPI(pH 5.9)均为球形，表面较SPI略粗糙,颗粒大小均一，虽有部分聚集在一起，但仍以单独的颗粒呈现，表观粒径较SPI大；这些结果与DLS测得的结果一致。
而加热使得肽段伸展并吸附在颗粒的表面，因此HSPI和HSPI(pH 5.9)的表面呈现粗糙状。得出结论，通过在95 ℃加热SPI溶液(pH 5.9)30 min诱导了SPI发生自组装，形成了具有核-壳结构的球形SPI纳米颗粒。此外，与DLS测定的平均粒径相比，TEM的结果普遍偏小，可能与空气干燥过程及颗粒在干燥过程中的结构收缩有关。
2 SPI与Cur相互作用研究
如图2A～C所示，在280 nm的激发波长处，SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）都呈现出强荧光强度，其中SPI在334 nm波长处具有最大荧光强度，HSPI和HSPI（pH 5.9）在340 nm波长处具有最大荧光强度。这一现象表明经过热处理后SPI内源疏水氨基酸所处微环境更加亲水。而随着加入的Cur浓度（0～10 μmol/L）增加，蛋白质的荧光强度逐渐降低，并且最大荧光发射波长发生蓝移，表明Cur与蛋白质的疏水性氨基酸发生了结合，使得它们所处的微环境极性降低，说明了Cur与SPI结合的作用力主要是疏水相互作用。
为了更直接的表征两者结合的亲和力，通过Stern-Volmer方程计算Cur对SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）内源荧光的猝灭常数（Ksv）。以F0/F为纵坐标、Cur浓度为横坐标作图（图2D），经线性拟合后发现Cur浓度与SPI、HSPI和HSPI（p H 5.9）三者的F0/F值都呈现出良好的线性关系（R2≥0.99），表明Cur可均匀的结合在蛋白的疏水基团上。计算得到SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）与Cur结合的Ksv值分别为0.274、0.454、0.550 μmol/L，可以发现热处理SPI的Ksv值相比SPI显着提高（P＜0.05），并且HSPI（pH 5.9）猝灭效果更加显着，说明HSPI（pH 5.9）与Cur之间具有更高的亲和力，这是HSPI（pH 5.9）表面疏水性高赋予蛋白的独特性质。
Cur的固有荧光对其周围环境的极性高度敏感，因此，研究了不同SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）浓度下Cur的荧光特性。如图3所示，没有SPI的情况下在420 nm波长处激发游离Cur时呈现的荧光峰强度非常低。随着蛋白质量浓度（0～5 mg/mL）的增加，Cur的最大荧光强度也随之增加，这表明SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）有效提高了Cur的溶解性。另外，Cur的最大荧光发射波长从长波长向短波长变化，这种荧光峰的蓝移表明Cur向极性更小的环境移动。由图3还可看出，HSPI（pH 5.9）对于Cur荧光强度的提高相比SPI和HSPI更加显着，该结果与图2结果一致。综上，具有核-壳结构的HSPI（pH 5.9）纳米颗粒与Cur具有强结合亲和力，这主要是归因于Cur与蛋白质之间的疏水相互作用，这种核-壳结构对于提高Cur溶解性有显着效果，可用于荷载及递送Cur的潜在壁材。
3 SPI-Cur纳米颗粒的形成与表征
3.1 SPI-Cur中Cur的水溶性及其粒径和分布
SPI-Cur纳米颗粒中Cur的含量是评价其对Cur是否成功包载及增溶的有效依据。将SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）与Cur粉末混合搅拌后经均质或超声，离心后得到的上清液为黄色、透明状液体（图4A），超声处理对SPI提高Cur水溶性更加有效，说明超声处理有利于蛋白与Cur之间的结合。
值得关注的是，超声后HSPI（pH 5.9）可将Cur粉末在水中的溶解量提高至12.43 μg/mL，相比Cur粉末在水中的溶解度11 ng/mL，其溶解度提高了1 130 倍左右。除了HSPI（pH 5.9）蛋白自身表面疏水性高以及超声的驱动作用影响外，HSPI（pH 5.9）的核-壳结构中大量疏水基团形成的强疏水内核更有利于与Cur的结合也是主要原因（图5)。
SPI-Cur颗粒的平均粒径及其分布如图4B所示，与SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）相比，均质后SPI-Cur、HSPI-Cur和HSPI（pH 5.9）-Cur颗粒粒径以及PDI大小的变化均不显着。与均质后样品颗粒相比，经超声处理得到的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur颗粒平均粒径均减小，但PDI值没有显着变化。与之不同的是超声后U-HSPI（pH 5.9）-Cur颗粒粒径虽略有增加，但分散性却依旧保持良好。
3.2 蛋白-Cur纳米颗粒荧光光谱研究
进一步利用荧光光谱研究蛋白-Cur纳米颗粒中蛋白质及Cur结构的变化。从图6A、B可以发现，经过均质或超声处理后，SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）的内源荧光最大发射波长均发生了红移，这可归因于均质和超声增加了蛋白的溶解度，使得疏水基团所处环境极性增强。由于Cur与蛋白结合，导致了蛋白内源荧光不同程度的猝灭，说明它们之间主要通过疏水相互作用而结合。此外，由蛋白-Cur纳米颗粒中Cur的荧光光谱结果表明超声处理后荧光强度比均质后更低，超声颗粒中Cur的最大发射波长红移，说明超声可以诱导SPI与Cur共组装。
图6C、D对Cur荧光的研究结果表明SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）与Cur作用后，增强了Cur的荧光强度，改善了Cur的溶解性，超声处理后效果更加显着。无论是均质还是超声形成的纳米颗粒，都表明了HSPI（pH 5.9）与Cur结合的能力更强，蛋白质荧光猝灭和Cur荧光增强与蛋白-Cur纳米颗粒中Cur水溶性提高的结果一致。综上结果表明，超声处理可以增强SPI与Cur的相互作用，进而提高Cur的水溶性，HSPI（pH 5.9）的核-壳结构更有利于与Cur在均质和超声过程中的共组装形成均一分散性好的纳米颗粒。
4 超声后蛋白-Cur纳米颗粒的贮藏稳定性
为了考察蛋白-Cur颗粒（U-SPI-Cur、U-HSPI-Cur和U-HSPI（pH 5.9）-Cur）中Cur以及颗粒本身的贮存稳定性，在25℃贮存30 d进行监测。图7A显示，新鲜制备的U-SPI-Cur和U-HSPI-Cur中Cur含量迅速减少，第3天时上清液中Cur的保留率分别仅有50%和60%，随着贮藏时间的延长，Cur的保留率缓慢降低，而U-HSPI（pH 5.9）-Cur中Cur含量在7 d后才开始逐渐降低。在贮存30 d后，U-HSPI（pH 5.9）-Cur中Cur保留率为77%，远高于U-SPI-Cur（35%）和U-HSPI-Cur（44%）。从图7B、C可以看出，贮藏过程中，超声后形成的蛋白-Cur颗粒粒径和PDI均保持稳定。上述实验结果表明，相比SPI和HSPI，HSPI（pH 5.9）的核-壳结构对Cur的保护作用更佳，形成的纳米颗粒具有良好的贮藏稳定性。
结 论
本实验以SPI为原料，在pH 7.0和pH 5.9条件下对其进行静态热处理，得到了SPI、HSPI和HSPI（pH 5.9）3 种蛋白颗粒，其中HSPI（pH 5.9）是具有疏水核心和亲水壳的核-壳结构，它们均可通过疏水相互作用与Cur结合以提高Cur的水溶性。通过均质或超声等物理处理可成功制备SPI-Cur纳米颗粒，其中超声处理对于增强蛋白与Cur之间的相互作用更加显着。HSPI（pH 5.9）的核-壳结构更加有利于蛋白在超声过程中与Cur发生共组装，形成粒径小（＜120 nm）、分散均一（PDI＜0.2）的U-HSPI（pH 5.9）-Cur纳米颗粒，极大提高Cur的水分散性及贮藏稳定性。综上研究结果表明，HSPI（pH 5.9）可作为潜在的优质纳米级壁材用于Cur等疏水活性物质的包埋与输送。
