已有研究证明乳铁蛋白（Lf）具有促进成骨细胞增殖的作用，本课题组前期的研究发现Lf及其消化产物都能促进BMSCs向成骨分化。BMSCs是骨重建中新骨形成的主要来源，在三唑酮作用下，BMSCs发生损伤，Lf修复损伤后的BMSCs活性及增殖能力成为关注的热点之一。
东北农业大学食品学院、乳品科学教育部重点实验室的谢银丹、赵添玉和刘宁*等人利用三唑酮作用于骨髓间充质干细胞建立BMSCs损伤模型，研究Lf对三唑酮损伤BMSCs 的修复作用，以期为今后三唑酮残留对BMSCs定向分化的影响研究提供量化参考，也为Lf的深度开发和调控个体生长发育提供新的理论参考。
1 三唑酮对BMSCs存活率的影响
由图1可知，与对照组（0 μg/mL）比较，采用不同质量浓度（0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL）的三唑酮处理1 d时，20 μg/mL三唑酮能对BMSCs造成损伤，其余较低质量浓度三唑酮会不同程度促进BMSCs增殖；当处理时间延长至3、5、7 d时，不同质量浓度的三唑酮均能对BMSCs造成显着损伤，且三唑酮对BMSCs的损伤作用在所选范围内呈现质量浓度-效应关系和时间-效应关系。根据三唑酮造成的细胞存活率的半数致死量，以及考虑到损伤时间的长短，本研究选取20 μg/mL的三唑酮处理3 d作为构建BMSCs损伤模型的条件，此条件下的细胞存活率为55.41%。
2 Lf对BMSCs增殖的影响
由图2可知，与对照组（0 μg/mL）比较，采用不同质量浓度的Lf处理BMSCs 1、3、5、7 d，均能不同程度地提高BMSCs的存活率。随着作用时间的延长，Lf对BMSCs的增殖作用显着增加，5 d时作用效果最明显；这说明Lf在10～200 μg/mL范围内对BMSCs无毒性作用且能促进其增殖，其中100 μg/mL的Lf作用最显着。
3 Lf对损伤BMSCs存活率的影响
结果显示，与空白对照组比较，三唑酮损伤处理不同时间后，BMSCs存活率均显着下降（P＜0.05）；对损伤模型加入Lf处理不同时间，结果显示均能显着提高BMSCs存活率（P＜0.05）。
4 Lf对损伤BMSCs成骨分化过程中分泌ALP的影响
结果显示，与空白对照组相比，三唑酮组诱导处理后，ALP质量浓度显着降低（P＜0.05）；Lf组和Lf修复组的ALP质量浓度显着增加（P＜0.05）。由此可知，Lf可有效修复三唑酮对细胞成骨分化造成的损伤。
5 Lf对损伤BMSCs成骨分化过程中分泌OCN的影响
OCN是成骨分化特异性表达的胞外基质蛋白，因OCN仅在成骨细胞内表达，故可以作为特异性指标来评价BMSCs的成骨分化能力。结果显示，与空白对照组相比，三唑酮组诱导处理后，OCN质量浓度显着降低（P＜0.05）；Lf组和Lf修复组的OCN质量浓度显着增加（P＜0.05）。由此可知，三唑酮会对细胞向成骨分化造成一定损伤，而Lf可有效修复这种损伤。
6 Lf对损伤BMSCs成骨诱导21 d后矿化结节形成的影响
由图4可以看出，与空白对照组相比，三唑酮组细胞形状仍为长梭形，极少有矿化结节形成，说明三唑酮对BMSCs向成骨分化造成了损伤；Lf组形成的矿化结节最多，说明Lf对BMSCs向成骨方向进行分化具有促进作用；Lf修复组和三唑酮组相比矿化结节数量更多，成骨分化较为明显，说明Lf可修复三唑酮对BMSCs向成骨分化造成的损伤。
7 Lf对损伤BMSCs成脂诱导21 d后脂滴形成的影响
由图5可以看出，与空白对照组相比，三唑酮组出现脂滴数量最多，说明三唑酮会使BMSCs向成脂方向进行分化；Lf组脂滴数量最少，这说明Lf能抑制脂滴生成；Lf修复组脂滴数量少于三唑酮组，说明Lf对三唑酮促进BMSCs向成脂分化的进程有拮抗作用。
8 成骨诱导21 d后成骨分化基因的表达
结果显示，与空白对照组比较，Lf处理后成骨分化中关键基因的表达水平都有所提高，Lf组ALP、BMP-2、Osteorix、Col I、Runx2、OCN基因表达分别上调52%、14%、50%、18%、70%、186%；Lf修复组上述基因分别上调28%、3%、50%、14%、17%、52%；三唑酮组上述基因分别下调24%、42%、50%、57%、50%、12%。Lf组成骨分化主要基因的上调比例大于Lf修复组。
9 成脂诱导21 d后成脂分化基因的表达
结果显示，与空白对照组比较，Lf处理后都下调了成脂分化中关键基因的表达水平，Lf组PPAR-gamma、LPL、FABP4基因分别下调23%、26%、10%；Lf修复组上述基因分别下调4%、12%、0.5%；三唑酮组上述基因分别上调8%、25%、21%。
讨 论
本研究选择BMSCs作为细胞模型研究三唑酮对细胞增殖分化损伤及Lf对此损伤的修复作用，选用6 个三唑酮质量浓度梯度（0.01、0.1、1、5、10、20 μg/mL）作用于BMSCs，暴露时间1 d时，最高质量浓度（20 μg/mL）三唑酮能对BMSCs造成损伤，其余较低质量浓度三唑酮会不同程度促进BMSCs增殖；当暴露时间延长至3、5、7 d时，不同质量浓度的三唑酮均能对BMSCs造成显着的损伤，细胞存活率随着暴露时间显着降低，说明三唑酮在所选剂量和时间范围内可抑制BMSCs增殖活性，对BMSCs具有损伤作用。三唑酮细胞毒性作用随暴露时间的逐渐增强。
Lf可能对这种损伤具有修复作用，所以选用6 个Lf质量浓度梯度（10、20、50、100、150、200 μg/mL）作用于BMSCs后计算细胞存活率，结果表明，Lf对BMSCs无毒性作用且能促进BMSCs的增殖，其中100 μg/mL的Lf作用最显着。分析Lf作用于BMSCs损伤模型后的细胞存活率、ALP质量浓度、OCN质量浓度、茜素红染色、油红O染色和定向分化基因表达变化，结果表明：三唑酮损伤BMSCs后，细胞存活率显着降低，细胞ALP、OCN质量浓度显着降低，矿化结节形成极少，脂滴数量增多，成骨分化相关基因的相对表达显着降低，成脂分化相关基因的相对表达显着增加。而100 μg/mL的Lf就能够提高损伤BMSCs的细胞存活率，增加细胞ALP、OCN水平，增加细胞的矿化结节，减少脂滴的生成，增加成骨分化相关基因的相对表达，减少成脂分化相关基因的相对表达。
综上所述，Lf能够促进骨髓间充质干细胞增殖，使BMSCs向成骨方向进行分化，更好地促进新骨形成，也对三唑酮所诱导的骨髓间充质干细胞损伤具有修复。本研究可以为今后三唑酮残留对BMSCs定向分化的影响提供一定的理论依据，也为Lf调控个体生长发育提供新的理论参考，对于三唑酮在体内的代谢作用机制还有待进一步研究。
