仙草味涩、性寒，具有清暑凉血及利尿之功效，主治中暑、消渴、感冒、高血压、黄疸、肾脏病和糖尿病等，全草可入药。同时，仙草食用历史悠久，加工利用价值高，以其为原料的凉茶、仙草冻、仙草茶、烧仙草等多种食品广受欢迎。目前仙草主要用于凉茶饮料生产，近年来在国内凉茶产业的带动下，仙草的种植面积和产量迅速增加。但是，仙草用途的单一性也造成其对凉茶产业的过度依赖，增加了种植风险。为此，亟需深入研究仙草的活性成分，充分挖掘其深层次开发利用价值，丰富产品结构，这对延伸和完善仙草种植和加工产业链，发展地方经济具有重要的现实意义。随着人们对安全与健康的日益关注，以天然抗氧化剂取代合成抗氧化剂是食品行业的发展趋势，因此仙草多糖作为高效安全的天然抗氧化剂具有广阔的开发前景。
集美大学食品与生物工程学院的何传波、邓婷和熊何健*等人以福建仙草为原料，通过离子交换层析和凝胶柱层析对碱法提取的仙草粗多糖进行分级纯化，构建了人体肝细胞LO2的过氧化氢（H2O2）损伤模型，通过测定乳酸脱氢酶（LDH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）活力和丙二醛（MDA）含量等指标，从细胞水平上探讨仙草多糖对氧化损伤细胞的保护作用，以期为仙草多糖天然抗氧化剂的开发利用提供数据支持。
1 仙草多糖的组成
采用NaHCO3溶液浸提仙草多糖，在前述制备条件下，多糖得率为8.1%。得到的仙草粗多糖JMBP-C经离子交换和凝胶柱层析纯化后得到3 个组分JMBP-N、JMBP-A1和JMBP-A2，其中，JMBP-N为超纯水洗脱的中性糖组分，JMBP-A1和JMBP-A2为NaCl梯度洗脱的酸性多糖组分。各组分占初始进样量（1 g）的比例分别为22.14%、28.97%和34.07%（以多糖含量计算），多糖总回收率为85.18%。
观察其外观形态，4 种组分的颜色为白色或浅黄色；质地轻，溶解性良好，溶于水后接近透明。4 种组分蛋白含量都很少，除了中性糖组分JMBP-N外，另外3 种多糖均含有较多的糖醛酸，以JMBP-A2的质量分数最高，达到59.14%。仙草的凝胶性是其食品加工的重要特性，根据糖醛酸含量较高的果胶成胶机理推测，糖醛酸可能在仙草凝胶过程中也起着重要的作用。在后续的研究中也证实了这一点，中性糖JMBP-N无法与淀粉形成凝胶，只有2 种酸性多糖组分才可以成胶。
单糖组成分析是研究多糖结构、性质等的基础，对纯化后的3 种多糖样品进行水解衍生后，通过高效液相色谱测定仙草多糖的单糖组成，结果显示，中性糖JMBP-N的单糖组成较为简单，由甘露糖（Man）、葡萄糖（Glu）和半乳糖（Gal）组成，以半乳糖质量分数最高。2 种酸性糖中，JMBP-A1由甘露糖、鼠李糖（Rha）、半乳糖醛酸（GalA）、葡萄糖、半乳糖、木糖（Xyl）组成，以木糖质量分数最高，JMBP-A2由甘露糖、鼠李糖、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖（Ara）和岩藻糖（Fuc）组成，以半乳糖醛酸的质量分数最高。
2 仙草多糖的分子质量
采用凝胶渗透色谱-多角度激光光散射法分析3 个纯化组分的重均分子质量（Mw），结果显示，对比各组分的多分散性（Mw/Mn）可知，JMBP-N和JMBP-A2的多分散性值接近1，说明该样品纯度较高，而JMBP-A1的纯度相对较低。3 种多糖组分中JMBP-A1的分子质量最大，为15.19 kDa，其次是JMBP-A2，为12.06 kDa，JMBP-N的分子质量最小，为1.25 kDa，表征分子尺寸的均方根旋转半径由大到小也是JMBP-A1＞JMBP-A2＞JMBP-N。
3 仙草多糖对H2O2损伤细胞的影响
3.1 仙草多糖对正常细胞生长的影响
为了确定仙草多糖对正常细胞的毒性作用，在构建细胞氧化损伤模型前，首先探讨了不同质量浓度的仙草粗多糖及3 种纯化样品对正常LO2细胞生长的影响，以细胞生长率为检测指标，结果如图1所示，细胞存活率的检测采用MTT比色法。结果表明，仙草多糖在质量浓度0.005～2.5 mg/mL范围内均对LO2细胞的生长无明显影响，细胞存活率都达到90%以上。当质量浓度达到5 mg/mL时，4 种多糖样品组的细胞存活率明显下降，分别下降到正常对照组的21.63%、72.72%、88.70%和92.02%，说明高质量浓度的仙草多糖对LO2细胞的生长有一定的抑制作用，缩小多糖处理质量浓度范围为0.125、0.25、0.5、1、2 mg/mL（图1B）。LO2细胞的存活率均在90%以上，细胞增殖率均在10%以下，多糖对细胞生长无显着增殖或衰亡作用，因此确定以此多糖质量浓度范围进行进下一步实验。
3.2 细胞氧化损伤模型的建立
不同细胞对H2O2氧化损伤的耐受程度不同，需要确定氧化损伤模型的H2O2浓度，筛选条件为与空白对照组比较达到半数细胞致死。不同浓度H2O2处理对LO2细胞存活率的影响如图2所示。结果表明，细胞存活率随H2O2浓度的增加明显呈下降趋势，浓度为4 mmol/L时，细胞的存活率为51%，接近半数致死，当浓度为10 mmol/L，细胞存活率甚至低至20%左右。因此，选择H2O2浓度4 mmol/L建立LO2细胞损伤模型。
3.3 仙草多糖对氧化损伤细胞的保护作用
仙草多糖对H2O2诱导LO2细胞氧化损伤的保护作用见图3。与H2O2模型组相比，JMBP-N对细胞氧化损伤基本无保护作用，JMBP-A1的保护效果最好，其各质量浓度组的细胞存活率均极显着增长（P＜0.01），0.5 mg/mL时，细胞存活率比模型组增加49.47%。JMBP-C组和JMBP-A2组在质量浓度为0.125 mg/mL时细胞存活率增长显着（P＜0.05），质量浓度达到0.25 mg/mL以上时细胞存活率增长极显着（P＜0.01），表明仙草多糖对H2O2诱导LO2细胞氧化损伤有保护作用。因此选择JMBP-C、JMBP-A1及JMBP-A2进行后续的抗氧化实验，选取多糖样品质量浓度0.125、0.5 mg/mL和2 mg/mL进行后续抗氧化指标的测定。
3.4 仙草多糖对氧化损伤细胞LDH的影响
从图4中可看出，H2O2作用于LO2细胞后，LDH释放量为正常对照组的1.24 倍，呈极显着升高（P＜0.01）。仙草多糖能明显减少培养液中LDH的释放，且随着多糖剂量的增大，效果越明显，呈现一定的量效关系，与模型组相比，3 种多糖样品组在高剂量（2 mg/mL）时均达到达到极显着水平（P＜0.01）。粗多糖和2 种纯化多糖相比，各剂量组均没有显着差异。与阳性对照组相比，3 种多糖样品的中、低剂量组降低LDH释放的水平相当，无显着差异。但VC高剂量组降LDH的效果极显着高于多糖样品组（P＜0.01）。这表明仙草多糖能有效降低氧化损伤细胞的LDH释放，对氧化损伤细胞有一定的保护作用。
3.5 仙草多糖对氧化损伤细胞抗氧化酶活力的影响
GSH-Px能够催化GSH转化为GSSG，对防止体内自由基引起的膜脂质过氧化起着重要作用。仙草多糖对细胞内GSH-Px活力影响结果如图5所示，可以看出，模型组细胞内GSH-Px活力降低到正常对照组的48.49%，达到极显着水平（P＜0.01），表明氧化损伤后会大幅降低细胞GSH-Px活力。与模型组相比，3 种多糖样品组能明显提高GSH-Px活力，且随着多糖质量浓度升高，GSH-Px活力也呈上升趋势。JMBP-A2对GSH-Px活力的提高作用最强，3 个剂量组提升作用均达到极显着水平，JMBP-A1作用次之，在中、高剂量组能达到极显着效果，而JMBP-C在高剂量时才能极显着提高GSH-Px活力。说明仙草多糖可以有效提高氧化损伤细胞的GSH-Px活力，可以通过抑制膜脂质过氧化而发挥其抗氧作用。
与阳性对照VC相比，仙草多糖提高GSH-Px活力的效果稍差，VC的高剂量组能将损伤细胞的GSH-Px活力提高到正常细胞的83.60%，而JMBP-A2的高剂量组只能提高到正常细胞的71.01%。但是，仙草多糖的低剂量组提高酶活力的效果要远高于VC，JMBP-A2的低剂量组能将GSH-Px活力提高到正常细胞的69.20%，而VC的低剂量组只能提高到正常细胞的53.59%。
SOD通过清除O2-·而发挥抗氧化作用，图6显示，模型组细胞内SOD活力较正常对照组极显着降低64.48%（P＜0.01），表明氧化损伤能降低SOD活力。与模型组相比，3 种多糖样品组能提高SOD活性，但提升效果不如GSH-Px，且JMBP-C和JMBP-A1随质量浓度升高，呈现一定的量效关系。3 种多糖样品中，JMBP-A1提高SOD活力能力最强，其高剂量组将SOD活力恢复到正常对照组的80.32%，极显着高于模型组（P＜0.01），与VC高剂量组接近（正常对照组的84.37%）。表明仙草多糖能提高受损细胞中SOD活力，防止其受损后快速氧化，具有一定的保护能力。
图7是仙草多糖对细胞内CAT活力的影响，结果显示，氧化损伤能显着降低CAT活力，模型组细胞内CAT活力降低到正常对照组的42.20%，且达到极显着水平（P＜0.01）。仙草多糖能明显提高受损细胞内CAT活力，与模型组比较，3 种样品的各质量浓度均达到极显着水平（P＜0.01）。3 种多糖样品中，JMBP-A1提高CAT活性能力最强，3 个剂量组均与对照组无显着差异，其高剂量组将受损细胞的CAT活力提高了108.82%，将CAT活力恢复到正常对照组的88.14%。
3.6 仙草多糖对氧化损伤细胞MDA含量的影响
MDA作为脂质过氧化的生物标记物之一，其含量可以间接地反映细胞受损伤程度。由图8可知，模型组细胞MDA含量为正常对照组的1.63 倍，极显着升高（P＜0.01），表明细胞受到氧化损伤后会大量增加MDA生成。与模型组相比，3 种多糖样品均能有效减少MDA生成，两种纯化多糖的中、高剂量组均达到显着水平（P＜0.05）。3 种多糖中，JMBP-A1降MDA效果最好，中剂量组使受损细胞的MDA含量降低了31.50%，与VC中剂量组效果（32.00%）接近。
讨 论
本实验采用碱液浸提法从仙草中提取多糖，通过离子交换、凝胶柱层析和超滤方法对粗多糖成分进行分离纯化，获得3 种单一的多糖组分，并构建了人肝LO2细胞的H2O2损伤模型，通过细胞质膜标记酶LDH的释放、抗氧化酶GSH-Px、SOD、CAT的活力和脂质过氧化物MDA的含量探讨不同仙草多糖对氧化损伤细胞的保护作用。
本实验采用H2O2对人肝LO2细胞进行氧化损伤，结果表明，细胞存活率随H2O2浓度的增加明显呈下降趋势，H2O2浓度为4 mmol/L时，细胞的存活率为51%。经2 h的H2O2处理，LDH释放量极显着增加到正常细胞的1.24 倍，细胞内抗氧化酶GSH-Px、SOD和CAT活力分别降低到正常对照组的48.49%、64.48%和42.20%，且均达到极显着水平（P＜0.01），同时，还使得脂质过氧化物MDA含量极显着增加到正常细胞的1.63 倍。
本研究采用氧化损伤模型对不同质量浓度仙草粗多糖JMBP-C及纯化样品JMBP-A1和JMBP-A2的抗氧化活性进行评价。结果表明，仙草多糖能显着增加氧化损伤细胞的存活率，JMBP-A1在0.5 mg/mL质量浓度时，细胞存活率比模型组增加49.47%，高于阳性对照。3 种多糖样品能明显降低上清液中LDH的泄漏量以及MDA的生成量，同时，显着增加受损细胞内GSH-Px、SOD和CAT 3 种抗氧化酶的活力。很多研究者认为植物多糖通过清除各种活性氧自由基，减少脂质过氧化产物丙二醛的生成量，提高如SOD、GSH-Px等抗氧化酶的活性，通过多种途径发挥抗氧化作用。综合现有关于仙草多糖抗氧化活性的报道发现，鲜有对纯化多糖的抗氧化活性进行研究，因此，本实验是对现有研究的有效补充。
本实验得到的4 种多糖样品，JMBP-N不含有糖醛酸，没有表现出明显的抗氧化活性，JMBP-C、JMBP-A1、JMBP-A2均含有糖醛酸，都表现出一定的抗氧化活性。JMBP-A2糖醛酸含量最高，但在多项抗氧化指标中并没有表现出最强的活性，这说明糖醛酸基团的存在与否可能是影响其抗氧化活性的重要因素，但是糖醛酸含量和活性并不是简单的正相关。另外，比较粗多糖和纯化多糖的活性发现，粗多糖表现的活性最弱，表明采用柱层析和超滤方法不仅能较好地对粗多糖进行分级纯化，并且也有助于获得生物活性更高的组分。但是，在个别指标，如降低LDH漏出量方面表现较好，推测可能是因为粗多糖中除多糖外，还含有黄酮等抗氧化活性物质所致。
福建作为全国仙草种植面积最大的省份，在行业里存在加工产品单一，全值化、高值化利用水平低的问题。而作为仙草中含量最高的多糖，其工业化提取、纯化、加工及活性研究更是仙草综合利用过程中首先需要解决的问题。本研究证实了仙草多糖对氧化损伤细胞具有良好的保护作用，是一种具有很大开发潜力的天然抗氧化功能因子，因此，后续应进一步完善制备工艺，并深入探讨其抗氧化作用机制。
