除了机体自身抗氧化酶系统发挥防护氧化应激的作用机制外，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1（Keap1）-核因子-E2相关因子（Nrf2）/抗氧化反应元件（ARE）信号通路被认为是机体最重要的内源性抗氧化信号通路。Keap1-Nrf2/ARE途径表达的蛋白质分子为机体提供了重要的防御作用，是对抗环境有害物质损伤和内源性应激的有力武器。分析该信号通路中重要活性分子的表达水平变化，对于深入分析物质发挥防护氧化应激损伤的内在机制具有非常重要的意义。
鉴于此，北京工商大学理学院、植物资源研究开发北京市重点实验室的张佳婵、邵卿和王昌涛*等人以实验室保存灵芝菌种G055为研究对象，采用常规热水浸提法对GLP进行工艺条件的优化，并进一步初步纯化及分析。同时以H2O2诱导的人皮肤成纤维细胞（HSF）损伤模型为研究载体，分析GLP及其组分对细胞内活性氧（ROS）、丙二醛（MDA）及相关抗氧化酶的作用效果，评价GLP对H2O2诱导的HSF氧化应激的保护及修复功效；最后，以Keap1-Nrf2/ARE信号通路上下游关键调控因子为重要考察对象，探究其在mRNA水平的变化。
1 GLP的提取及纯化工艺
1.1 GLP的提取工艺优化
固定料液比为1∶50（m/V），浸提温度为70 ℃，浸提1 次，考察浸提时间对多糖提取率的影响。结果显示，提取时间为1 h时，GLP提取率最高；提取时间在1.5～2.5 h范围内，提取率无显着性差异（P＞0.05）；当提取时间延长至3 h时，GLP提取率最低。因此，从节约角度出发，选择1 h作为最优提取时间。
固定料液比为1∶50（m/V），浸提时间为2 h，浸提1 次，考察浸提温度对GLP提取率的影响，实验结果显示，70 ℃时多糖提取率达到最大，且与其他条件相比差异显着（P＜0.05），故确定最佳浸提温度为70 ℃。
固定浸提时间为2 h，浸提温度为70 ℃，浸提1 次，考察料液比对GLP提取率的影响，结果显示，当料液比为1∶30和1∶60（m/V）时，多糖提取率最高，两者之间无显着性差异（P＞0.05），但与其他条件相比显着提高了GLP提取率（P＜0.05）。考虑原料成本因素，在该条件下的最优单因素提取条件确定为料液比1∶30（m/V）。
固定料液比为1∶50（m/V），浸提时间为2 h，浸提温度为70 ℃，考察浸提次数对多糖提取率的影响，实验结果显示，随提取次数的增加，多糖提取率大幅下降，第二次提取率仅为（8.05±1.34）%，综合考虑，选择浸提次数为1 次。
结果显示，这3 个因素的最佳组合为A3B1C3。FA＝113.29、FB＝103.19、FC＝68.26，依照影响强度由大到小的顺序排列，得到三因素对GLP提取率的影响强弱顺序（由强到弱）为A＞B＞C。在最优提取工艺条件（料液比1∶35，m/V），浸提温度65 ℃，浸提时间1.5 h下进行验证，得到GLP提取率为（47.70±0.50）%，相对标准偏差为1.04%，再现性良好。利用该方法提取灵芝菌丝体多糖，其提取率远高于灵芝子实体。
1.2 GLP的纯化工艺
本实验对GLP进行了8 次去蛋白处理，结果如图2所示。蛋白的脱除率与处理次数呈正相关，首次处理后脱除率仅为（12.31±0.24）%，第8次可达（72.87±1.90）%。当用Sevag处理6 次后，蛋白质的脱除率变化不明显。考虑到多糖成分与有机试剂长时间接触可能会影响其生物活性，因此共进行6 次处理，此时蛋白的脱除率可达（66.68±1.13）%。
用DEAE-52离子交换树脂对脱蛋白后的GLP进行初步分离纯化，得到洗脱曲线。由图3可知，共4 个洗脱峰（I～IV）分别出现在90、390、690、990 mL处，收集合并各组分。考虑到GLP III和GLP IV吸光度较低，故仅选用第一组分（GLP I）和第二组分（GLP II）进行后续实验。将收集的组分透析后冷冻干燥，得到GLP I、II。
对GLP及其组分GLP I、GLP II进行衍生反应，利用GC-MS测定单糖组成。图4为GLP（A）、GLP I（B）、GLP II（C）的GC图谱。经过与标准品相对分子质量及标准曲线对比，GLP及其组分的单糖组成及物质的量比例结果显示，其中GLP I较GLP、GLP II多出鼠李糖和岩藻糖两种单糖，考虑为纯化后的富集作用所引起的。
2 GLP对H2O2诱导的氧化应激模型的保护和修复作用
2.1 GLP对氧化损伤细胞脂质过氧化产物积累情况的影响
图5A、B分别为保护和修复作用下GLP、GLP I、GLP II与VC对HSF细胞内MDA含量影响的结果。结果表明，100 μmol/L H2O2处理细胞2 h处理后Model组能够极显着提高细胞内MDA含量（P＜0.01）。与Model组相比，GLP、GLP I、GLP II、VC均能极显着减少HSF细胞内MDA的积累（P＜0.01）。在本实验所考察作用浓度下，各保护作用处理方式中，样品减少MDA积累的能力由高到低依次为GLP II＞VC＞GLP＞GLP I，修复作用中，样品降低MDA积累的能力由高到低依次为VC＞GLPII＞GLP＞GLP I，两种作用中VC与GLP II均不具有显着性差异（P＞0.05）。
2.2 GLP对HSF细胞内ROS水平的影响
保护与修复两种处理方式下GLP及其组分（GLP I和GLP II）与VC对细胞活性氧水平的影响结果如图6A、B所示。与Control组相比，H2O2处理后极显着提高了细胞内ROS水平（P＜0.01）。总体上看，两种作用方式下，GLP、GLP I和GLP II均能极显着降低HSF细胞内ROS的含量（P＜0.01），与阳性对照VC相比，GLPI在保护作用方面具有更为优异的表现。
2.3 GLP对氧化损伤细胞抗氧化酶水平的影响
在保护和修复两种方式下，GLP、GLPI、GLP II与VC对HSF细胞内CAT活性影响的结果显示，与Model组相比，两种作用方式处理下，GLP、GLP I、GLP II、VC均能极显着提高HSF细胞内CAT的活力（P＜0.01）；在本实验所考察作用浓度下，在保护作用处理方式中，各样品提高CAT的能力由高到低依次为：GLP I＞VC＞GLP＞GLP II，修复作用处理方式中为：GLP I＞GLP II＞VC＞GLP。
在保护和修复两种方式下，GLP、GLPI、GLP II与VC对HSF细胞内GSH-Px活力影响的结果表明，两种作用方式处理下，GLP、GLP I、GLP II与VC均能显着提高HSF细胞内的GSH-Px活力。在保护作用处理方式下，1.25 g/L GLP I处理HSF细胞24 h再进行H2O2损伤处理，其最终的GSH-Px活力达到（12.19±0.61）U/g，比Model组提高了36.84%；在修复作用处理方式下，GLP I组GSH-Px活力为Model组的7.56 倍，且3 种灵芝多糖处理后的GSH-Px水平均高于阳性对照VC。
在保护和修复两种方式下，GLP、GLPI、GLP II与VC对HSF细胞内SOD活力影响的结果。与Control组相比，Model组细胞内SOD活力显着降低（P＜0.05）。与Model组相比，GLP、GLP I、GLP II和VC均能极显着提高HSF细胞内SOD活力（P＜0.01）；并且GLP及其两组分的促进能力均高于阳性对照VC；GLP I的保护和修复能力最高，保护处理方式下，GLP I组SOD活力为Model组的2.39 倍；修复处理方式下，GLP I组的SOD水平为Model的2.92 倍，具有较好的提高SOD活力的能力。
3 GLP对H2O2诱导的氧化应激模型Keap1-Nrf2/ARE信号通路的影响
由前期实验可知，GLP、GLP I、GLP II的质量浓度均为1.25 g/L时，其活力均在80%以上，因此设定低（0.5 g/L）、中（1.5 g/L）和高（2.5 g/L）3个剂量来探究GLP对Keap1-Nrf2/ARE信号通路各因子表达水平的影响。图8为保护作用处理方式下，不同样品对Keap1-Nrf2/ARE信号通路关键信号分子的表达情况影响。由图8A可知，各灵芝多糖（GLP、GLP I和GLP II）处理后，Nrf2 mRNA表达量均极显着高于Model组（P＜0.01），并且显着高于阳性对照VC组。由图8B可知，与Model组相比，负调控因子Keap1的相对表达量变化趋势并不一致，在GLP低剂量组、GLP中剂量组、GLP I中剂量组、GLPII组高剂量组、GLP II组低剂量组中，Keap1表达受到极显着抑制（P＜0.01），而在其他组中显着高于Model组；阳性对照VC组的Keap1 mRNA相对表达量与Model组相比差异不显着（P＞0.05）。
在保护作用研究中，除GLP I中剂量组极显着降低了下游抗氧化因子HO-1的表达量，其他样品均能极显着提高HO-1的表达量（P＜0.01）（图8C）。GLP中剂量组、高剂量组的NQO1表达提高，且与Model组相比差异极显着（P＜0.01），GLP I、GLP II组在中剂量组显着表达（P＜0.05，P＜0.01）（图8D）。
图9 为修复作用处理方式下，不同样品对Keap1-Nrf2/ARE信号通路关键信号分子的表达情况影响。由图9A可知，在修复作用中，各灵芝多糖组除高剂量组外，Nrf2的表达量均极显着提高（P＜0.01）；阳性对照VC修复后，并没有提高Nrf2的相对表达量。由图9B可知，负调控因子Keap1在各灵芝多糖处理组中均极显着低于Model组（P＜0.01）。由图9C可知，GLP I、GLP II组中HO-1的表达量随质量浓度的增加先降低后升高，而HO-1仅在GLP低剂量组中极显着表达（P＜0.01）。由图9D可知，GLP高剂量组，GLP I、GLP II中剂量组的NQO1极显着表达（P＜0.01）。
讨 论
在本研究中，来源于菌种wG055的灵芝多糖GLP及其组分GLP I和GLP II同样具有显着的防护氧化应激损伤的功效。在保护和修复两种处理方式上，GLP及其组分显着降低了HSF损伤细胞MDA的积累和ROS水平，与文献[47]报道相符；并且，GLP可以显着提高细胞抗氧化酶的水平，对Keap1-Nrf2/ARE关键信号因子具有显着的调节作用，进一步解释了其发挥防护氧化应激方面的作用机制。
本实验为GLP在食品、药品领域的应用提供了一定的理论参考。但是，在机制研究方面可能还不全面，尽管Keap1-Nrf2/ARE信号通路是一条重要的内源性抗氧化信号通路，但是机体的内在平衡是多因子、多信号通路复杂调控的结果。后期可以借助组学技术对GLP的深层机制进行更系统、更全面的分析，阐明GLP发挥作用的深层机制。
