随着生物信息学不断发展，一种基于已知蛋白质氨基酸序列的虚拟筛选技术成为解决当前瓶颈的有效手段。计算机辅助水解工具ExPASy是瑞士生物信息研究所提供的数据工具平台，PeptideCutter可以预测蛋白质序列在特定蛋白酶条件下的切割位点。admetSAR是预测活性肽的吸收、分布、代谢、排泄和毒性（ADMET）化学性能的工具，能快速判断候选活性肽的生物活性和安全性，节省研发时间和经费的投入。
鸡蛋是良好蛋白质资源，因此，渤海大学食品科学与工程学院的于志鹏、樊玥、赵文竹*和吉林大学营养与功能食品研究室的刘静波*等人以鸡蛋蛋白质为原料，通过虚拟筛选的方法获得具有潜在ACE抑制活性的肽序列，并对其体外活性进行确证。同时，利用分子对接技术阐明ACE抑制肽与ACE的相互作用机制。本研究旨在为合理利用鸡蛋蛋白质资源，开发鸡蛋蛋白ACE抑制肽提供理论依据，具有广阔的应用前景和经济效益。
1 ACE抑制肽原料蛋白质的筛选
通过BIOPEP-UWM评估鸡蛋卵清蛋白、卵黄蛋白原-1前体、卵黄蛋白原-2前体和铁转运蛋白作为生物活性肽的潜在来源，结果表明其ACE抑制肽理论释放量分别为25.1%、8.5%、10.1%和17.2%，含有的ACE抑制肽理论片段分别为97、163、187和118，其中ACE抑制肽理论片段不包括重复序列。卵清蛋白、卵黄蛋白原-1前体、卵黄蛋白原-2前体、铁转运蛋白的蛋白质可以作为筛选ACE抑制肽的前体蛋白，其中卵黄蛋白原-2前体释放出理论种类最多的ACE抑制肽序列。此外，鸡蛋蛋白质水解产物的特征与其氨基酸含量及排列顺序有关。通过BIOPEPUWM评估，鸡蛋蛋白质可以作为潜在ACE抑制肽的蛋白来源。
2 虚拟筛选
2.1 虚拟酶解
使用胃蛋白酶（pH 1.3）和胰蛋白酶，通过ExPASy Peptide Cutter程序虚拟水解卵清蛋白、卵黄蛋白原-1前体、卵黄蛋白原-2前体和铁转运蛋白，虚拟水解得到大量的二肽、三肽和四肽等。将水解得到的所有三肽收集，并利用PeptideRanker程序进行生物活性预测，其中生物活性评分不小于0.5的肽认定为具有潜在高生物活性，并利用Innovagen程序预测其水溶性，最终获得了18种水溶性良好、具有潜在高生物活性的三肽，其中来自卵黄蛋白原-1前体的三肽为GDF、WGK、FKP、FDR、SDF、ACR、QWK、LGR、FQK和IGR，来自卵黄蛋白原-2前体的三肽为IWR、FTR、AWK和DIC，来自铁转运蛋白的三肽为ADW、SDF、CDR和DGG。虽然理论上卵清蛋白源释放的ACE抑制肽含量高，但是并没有在其中获得对应数量的三肽，这可能是因为卵清蛋白虚拟水解得到的三肽片段较少。
2.2 ADMET性质预测结果
研究发现，在上述18 种肽中，仅7 种肽WGK、QWK、FQK、AWK、DIC、ADW和SDF具有良好的ADMET特性，均表现为HIA+和BBB+，表明这些肽具有良好的小肠吸收性（＞30%）和血脑屏障透过性，且这7 种肽均无毒。
2.3 药效团模型
以6 个高活性的ACE抑制三肽IKW、LKP、LGP、PLG、FCF和FAL为训练集，产生了10 个药效团模型Hypothese 1、Hypothese 2、Hypothese 3、Hypothese 4、Hypothese 5、Hypothese 6、Hypothese 7、Hypothese 8、Hypothese 9和Hypothese 10，Rank值分别为86.625、85.470、85.334、85.248、85.202、84.856、84.775、84.773、84.635和84.491。药效团特征匹配数目是111111表示此药效团药效特征与6 个小分子均可匹配；部分匹配药效团特征数目表示此药效团药效特征中与6 个小分子部分匹配的药效特征数目为0；最大匹配值为5，表示5 个药效特征均可匹配。其中Hypothese 1的Rank值最高为86.625，表明活性化合物与药效团Hypothese 1匹配最好，构建的药效团模型最可靠。
实验以6 个活性分子、6 个中等活性分子和3 个无活性的ACE抑制肽对所获得的10个药效团模型进行验证。图1为测试集分子与药效团匹配生成的热图，颜色从红色到蓝色表示匹配度越来越高。由图1可知，药效团模型测试集中的12 个高活性及中活性肽序列VSV、LRP、IVY、GLP、LKA、LAP、PGL、VAF、AFL、YGL、KGP、RVR所对应的区域大部分显示橙色、黄色及浅绿色，而3 个无活性肽PER、YPF和NVR所对应的区域都显示为蓝色和深蓝色，能够较好地识别区分测试集中的活性分子和无活性分子。Hypothese 1与活性最好的分子区域呈明显的橙色，与无活性分子区域呈明显的蓝色，证明该模型最可靠。药效团模型通过分析三肽的氢键受体特征、氢键供体特征、疏水中心特征、负电离子中心特征和正电离子中心特征预测其生物活性，因此，利用Ligand Profile模块分析三肽WGK、QWK、FQK、AWK、DIC、ADW和SDF分别与Hypothese 1关键化学特征元素间的叠合情况，其Fit值分别为2.287、2.987、2.402、3.106、3.046、2.744和1.311。结果表明，SDF的Fit值最低，与Hypothese 1匹配度最低，因此，实验剔除掉三肽SDF，以剩余的6 种三肽WGK、QWK、FQK、AWK、DIC和ADW进行分子对接和活性验证。
2.4 分子对接与活性验证
通过分子对接中打分函数可知，ACE-WGK、ACE-QWK、ACE-FQK、ACE-AWK、ACE-DIC和ACE-ADW的“-CDOCKEREnergy”值分别为96.45、91.64、111.98、83.05、94.40、97.59 kcal/mol。“-CDOCKER Energy”值相对越高，表示其结合越紧密。结果表明，这6 种肽均可与ACE发生结合，ACE-FQK、ACE-WGK和ACE-ADW结合较好，即FQK、WGK和ADW可能具有更好的ACE抑制活性。
最后，通过与BIOPEP-UWM和AHTPDB数据库中已经发表的ACE抑制肽（2019年4月在BIOPEPUWM数据库处获得的数据）进行比较，结果表明，实验获得的3 种三肽均为首次研究报道。对三肽FQK、WGK和ADW进行Fomc法固相合成，并利用反相HPLC法检测其体外ACE抑制活性，IC50值分别为（250±0.25）、（222.74±1.02）、（85.38±0.54）μmol/L，其中ADW的活性最高。
3 ACE-肽的作用机制
通过CDOCKER程序研究了FQK、WGK和ADW对ACE的抑制机制，从分子角度阐述优选活性肽FQK、WGK和ADW与ACE的作用机制（3D模型见图2a、3a和4a）。由图2b可知，三肽FQK与ACE的氨基酸残基Ala354（2.07 ?/2.59 ?）、His353（2.18 ?）、His513（2.25?）、Tyr523（2.04 ?）、Tyr520（2.12 ?）、Lys511（1.85 ?）和Thr282（1.89?）之间形成了8 个不同距离的氢键，其中，FQK和氨基酸残基Ala354之间含有2 个氢键，与Lys511之间形成的氢键最短，结合最紧密；FQK与氨基酸残基His513（2.71?/3.08 ?）形成2 个不同距离的碳氢键，与His353（2.86 ?）的结合形成1 个碳氢键。FQK与氨基酸残基Val518（4.47 ?）形成疏水相互作用，Lys511和Glu376形成盐桥。
由图3b可知，在ACE-WGK复合物中，WGK与ACE中的氨基酸残基Gln281（2.03 ?）、Tyr520（1.97?）、Asp453（1.87 ?）、His353（2.53 ?/2.04 ?）、His513（2.09 ?）和Tyr523（2.20 ?）形成了7 个不同距离的氢键，与Glu384（2.70 ?）之间形成了1个碳氢键，与Lys511（2.01 ?）相互作用形成盐桥，与Lys511（2.01 ?）、Asp453（3.64 ?）和Glu376（5.04?）形成静电相互作用，与Val518（4.25 ?/4.36?）形成疏水相互作用。此外，WGK中的氧原子还与Zn701（2.17 ?）形成金属受体相互作用。ACE的活性中心含有二价锌阳离子的活性口袋，WGK和ADW和活性口袋中的残基发生作用，且具备能与锌离子有较强的结合能力，占据ACE的活性中心，使其活性降低。
由图4b可知，三肽ADW与ACE中的Gln281、Ala354以及Tyr523氨基酸残基之间形成了3 个氢键，氢键长度分别为2.25、2.91 ?以及2.66 ?；与His513（2.54 ?/2.76 ?）、His353（2.53 ?/2.61 ?）、Tyr523（2.66 ?）和His383（2.69 ?）之间形成了6 个不同距离的碳氢键。同时，ADW与氨基酸残基Lys511（1.81?）和Glu162（2.19 ?）形成盐桥，与His353（4.53 ?）发生静电相互作用，与氨基酸残基Ala356（5.45 ?）和Val518（4.87 ?）发生疏水相互作用。此外，ADW中的氧原子与Zn701（2.24 ?）形成金属受体相互作用，其余的氨基酸残基与ACE抑制肽形成的都是范德华力。活性口袋中的氨基酸是ACE与三肽分子相互作用的关键氨基酸，通过已经解析出的ACE晶体结构（PDB ID：1O86）可知，ACE主要含有3 个活性口袋S1（Ala354、Glu384 和Tyr523），S2（Gln281、His353、His513、Lys511和Tyr520）和S1’（Glu162）。研究表明，ACE抑制肽的氨基酸组成与其抑制活性密切相关，因此，三肽的氨基酸残基与ACE的相互作用关系的研究有助于ACE机理的解析。
结 论
目前，生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白酶和蛋白质的筛选上，在原料蛋白质和蛋白酶选择上具有盲目性。利用虚拟酶解等手段不仅可以明确肽序列，同时也可以预测实验选取的蛋白质是否可以作ACE抑制肽的原料蛋白，有利于选择今后实验研究的对象，同时为从原料蛋白质中寻找已知序列的生物活性肽提供了基础。本实验利用虚拟筛选、药效团模型并结合分子对接的方法获得了来自鸡蛋蛋白源的ACE抑制肽FQK、WGK和ADW，并对其体外ACE抑制活性和作用机制进行研究。实验表明鸡蛋蛋白源三肽FQK、WGK和ADW具有体外ACE抑制活性，IC50值分别为（250±0.25）、（222.74±1.02）、（85.38±0.54）μmol/L。研究发现FQK、WGK和ADW能与ACE的活性口袋S1、S2中的氨基酸残基发生作用，WGK和ADW与锌离子能够牢固的结合，且ADW是本研究中唯一一个与活性口袋S1’氨基酸残基Glu162形成相互作用的三肽，这也可能是ADW的体外ACE抑制活性最高的原因。虚拟筛选可以定向筛选ACE抑制肽，药效团为ACE抑制活性肽序列预测提供了辅助，与传统酶解方法相比降低了实验成本并提高了筛选鉴定ACE抑制肽的效率。
