海藻酸钠(SA)具有很好的溶胶-凝胶特性，被广泛应用于工业、农业、医药等众多领域；微孔淀粉(MS)表面布满均匀一致的孔洞，孔的容积约占总体积的50%，使其具有较大的比孔容和比表面积，其表面所具有的多个向中心延伸的微孔使淀粉材料具有特异的吸附性能。
山西农业大学食品科学与工程学院的张慧霞、王如福*和李建波等人通过采用SA作为固定化酶载体壁材，将吸附了酯化酶的MS作为芯材，将其包埋在SA与CaCl2形成的海藻酸钙凝胶网络中，采用包埋法制取固定酯化酶，以期研究较好的适于老陈醋催陈的固定化酶载体材料。本实验考察各因素对固定化工艺的影响，以及固定化酯化酶的微观结构，并将其应用于老陈醋新醋中催化酯化反应，以期缩短陈酿时间，提高生产效率，将酶固定后催陈新醋可避免游离酶催陈后酶分离难的问题，同时可提高酶的重复利用次数，节约成本。
1 固定化酯化酶制备工艺的优化
1.1 SA质量浓度对酶固定化效果的影响
结果显示，包埋率随SA质量浓度的增大而增大，酶活力回收率则是先增大后降低，当SA质量浓度为1 g/100 mL时，酶活力回收率仅为20%，SA质量浓度为2.5 g/100 mL时，其酶活力回收率可达到56%以上，质量浓度再增大，其活力回收率逐渐下降。这是由于当SA质量浓度较低时不足以包埋吸附有酯化酶的MS，由此导致酶的包埋率降低，从而酶活力回收率也降低；而当SA的质量浓度大于2.5 g/100 mL时，载体溶液与CaCl2形成的网络结构更加致密，导致传质阻力增加，降低了酶与底物的接触几率，导致酶活力回收率降低。
1.2 MS质量浓度对酶固定化效果的影响
酶活力回收率随着MS质量浓度的升高先升高后降低，这种现象可能与海藻酸钙网络结构能够包埋MS的量有关，当MS与SA的物质的量比值较高时，海藻酸钙形成的网络结构难以将吸附有酶的MS完全固定；若直接将酶液单独与SA混合，不添加MS进行吸附，其包埋率只能达到30%左右，说明MS对酯化酶的固定化起重要作用。
1.3 酶液质量浓度对酶固定化效果的影响
结果显示，当酶液质量浓度小于7 g/100 mL时，其酶活力回收率随酶液质量浓度的增加而增大，当大于7 g/100 mL时，其酶活力回收率略有下降，可能由于颗粒内部酶质量浓度过高，在MS吸附过程中堵塞了孔道，颗粒内部的酯化酶与底物接触的阻力增大，导致酶活力回收率降低。
1.4 CaCl2质量浓度对酶固定化效果的影响
结果显示，CaCl2质量浓度较低时对包埋率的影响 较弱，但总体呈上升趋势，这是由于CaCl2质量浓度较低时，酶和MS没有及时固定而溶于固化液中，随着CaCl2质量浓度增大，CaCl2与SA反应速度相对较快，其形成的海藻酸钙网络致密结构将酶和MS迅速包埋，减少酶流失；而随着CaCl2质量浓度的继续增大，酶活力回收率出现下降，这是由于高质量浓度的CaCl2离子强度较大，而酶活力受离子强度的影响会有相应的失活。
1.5 固定时间对酶固定化效果的影响
结果显示，固定时间对包埋率影响较弱，CaCl2与SA反应比较容易，但也需要一定时间固化才能够完全，0.5 h包埋率较低，可能是由于固化不完全，冲洗颗粒时将未包埋的酶和淀粉洗掉。固定时间为0.5～1.0 h时，酶活力回收率增大，当大于1.0 h时，酶活力回收率下降，由于随着固化时间的延长，固定化颗粒浸泡在CaCl2溶液中的时间较长，受离子强度影响的时间较长，导致酶活力下降。
1.6 正交试验优化固定化工艺条件
结果显示，以包埋率为评价指标时，其理论优水平为A3B1C3D1，实际优水平为A3B1C3D2，影响因素的主次顺序为A>B>D>C；以酶活力回收率为评价指标时，其理论优水平为A2B2C3D3，实际优水平为A2B2C3D1，影响因素的主次顺序为A>B>D>C，因此，通过验证实验验证理论和实际最优组合中的包埋率和酶活力回收率都相对较大的组合，以确定最佳固定化条件。
结果显示，以包埋率为评价指标时，其理论最优组合A3B1C3D1的包埋率最高；以酶活力回收率为评价指标时，实际组合A2B2C3D1的酶活力回收率最高。为提高酶的利用率应该选择包埋率相对较高，且酶活力回收率最高的组合作为固定化酶的最优条件，因此，确定A2B2C3D1为最优固定化条件，即SA质量浓度为2.5 g/100 mL，微孔淀粉质量浓度为1.5 g/100 mL，CaCl2质量浓度为3 g/100 mL，酶液质量浓度为6 g/100 mL，其酶活力回收率最高，为60.13%，酶活力达111.01 mg/(g·100 h)。
2 固定化酯化酶效果图和扫描电镜
固定化酯化酶效果图见图6。利用扫描电镜观察固定化酶载体材料及固定化酶颗粒的表面结构，如图7所示。由图7a2可以明显看出，SA与CaCl2反应后形成的海藻酸钙网络结构，图7b2、c2与a2对比，可以看到MS和酶被固定在海藻酸钙网络结构中。由图7d1可知，MS的表面布满均匀的小孔，孔洞较深，由图7d2可知，MS吸附酶液后，其表面不光滑，有明显异物附着，孔洞变浅。
3 固定化酯化酶催陈新醋
3.1 催陈温度对催陈效果的影响
结果显示，固定化酯化酶与游离酯化酶的催陈温度对催陈效果的变化规律基本一致，即在30～50 ℃催陈温度范围内随着温度的升高醋液中总酯含量呈先升高后下降的趋势，40 ℃为2 种状态酯化酶的适宜催陈温度，这与生物酶的活性随温度变化趋势相似。此外，在催陈温度低于45 ℃时固定化酯化酶的活性低于游离酯化酶，而当催陈温度达到 50 ℃时固定化酯化酶的活性高于游离酶，此现象表明酯化酶经过固定化以后在低温状态下出现一定惰性，而在高温状态下却会表现出对高温的耐受性，但在40 ℃时2 种状态酯化酶的催陈效果相当。
3.2 固定化酯化酶的添加量和催陈时间对催陈效果的影响
分别取固定化酯化酶1.5、3.0、4.5、6.0、7.5 g加入500 mL新醋液中，封口于40 ℃恒温培养箱，隔12 h测醋液中的总酯含量，研究固定化酯化酶的添加量和酯化时间对催陈效果的影响，如图9所示。固定化酯化酶添加量和催陈时间与新醋中总酯的生成量呈正相关，但当添加量大于4.5 g时，同等时间内总酯的生成量变化不大，且当催陈时间达到48 h，不同添加量下的醋液总酯含量基本达到一个水平，不再有显着增长，可能酯化反应已达到平衡。
固定化酶处理后醋液的总酸、不挥发酸质量浓度均降低，每100 mL醋液总酸降低0.104 g，不挥发酸降低0.042 g，醋液中的部分酸被酯化生成酯，固定化酯化酶处理后醋液的总酯升高0.304 g/100 mL，说明醋中酸、醇、酯在短期内达到了一定的平衡，能够缩短新醋陈酿时间。
讨 论
通过单因素和正交试验，优化得出采用SA-MS包埋法固定化酯化酶最佳工艺条件：SA质量浓度为2.5 g/100 mL，MS质量浓度为1.5 g/100 mL，酶液质量浓度为6 g/100 mL，CaCl2质量浓度为3 g/100 mL，固定时间1 h。在该条件下制备的固定化酶其酶活力回收率可达60.13%，包埋率达81.13%，且固定化酶热稳定性优于游离酶的。
将优化的固定化条件下制备的固定化酯化酶4.5 g置于500 mL新醋液中进行应用实验，40 ℃催陈48 h，醋液总酯质量浓度可达1.329 g/100 mL，比新醋增加0.304 g/100 mL，增长率为29.66%，醋液刺激味明显减弱。本实验所用醋液不挥发酸为1.305 g/100 mL(以乳酸乙酯计)，质量浓度较低，pH值为3.9(老陈醋 pH值范围为3.6～3.9)，在酯化酶使用的最适pH值范围内，本实验结果表明酯化酶催化以合成作用为主。酯化反应为可逆反应，底物质量浓度和pH值对酯化酶的合成反应和分解反应有一定影响，但醋液体系复杂，关于酯化酶催化新醋液中酯化反应以合成作用为主，还是分解作用为主需对其适宜的底物浓度和pH值等因素做进一步研究，对把握催陈过程具有一定意义。
