活性氧(ROS)是机体正常代谢产物，ROS浓度过高会导致机体发生氧化应激，机体内累积过多的ROS会造成多种疾病。萜烯类化合物是一类广泛存在于植物、动物体内的碳氢化合物。随着检测技术的发展，越来越多的萜烯类化合物在白酒中不断检测出，清香型与酱香型白酒中共检测到69 种。目前越来越多的证据表明，萜烯具有抗氧化活性。萜烯化合物中的双环倍半萜类β-石竹烯(BCP)具有重要的功能作用。虽然已有研究表明BCP和GAT具有功能活性，但所研究的剂量水平都远高于白酒中的水平，目前为止鲜有对白酒中、低质量浓度下BCP和GAT抗氧化作用的研究。
作为我国北方清香型的代表白酒之一，牛栏山二锅头酒以清香纯正、入口醇甜爽净、酒体协调、尾净香长的特点深受消费者喜爱。食品质量与安全北京实验室、北京食品营养与人类健康高精尖创新中心和北京市食品风味化学重点实验室的张倩以及北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂的朱婷婷、魏金旺*等人利用顶空固相微萃 取结合气相色谱质谱联用技术(HS-SPME-GC-MS)对13 种牛栏山二锅头原酒中的微量 萜烯化合物进行定性定量分析，同时按酒中剂量范围， 利用2,2’-偶氮双(2-甲基丙脒)二盐酸盐(2,2’-azobis(AAPH)诱导的 HepG2细胞氧化损伤模型探究其细胞内抗氧化活性，以 期为健康白酒的进一步研究与发展提供一定参考。
1 牛栏山二锅头酒中萜烯类化合物的确定
应用HS-SPME-GC-MS法对13 种牛栏山二锅头原酒和3 种商品酒中的萜烯类化合物进行测定，对GAT和BCP两种化合物通过内标物标准曲线准确定量，该方法能够满足白酒中痕量萜烯类化合物定量分析要求。由于β-大马酮、β-杜松烯和反式-橙花叔醇无标准品，单个化合物的相对含量采用其与内标物响应值的比进行半定量分析。
本实验准确定性定量的微量萜烯化合物有：GAT、BCP、β-大马酮、β-杜松烯和反式- 橙花叔醇，其中GAT为二锅头酒中首次检出。从单个萜烯来看，牛栏山原酒及商品酒中的质量浓度一般为一微克每升到几百微克每升，这5 种萜烯类化合物中，原酒中GAT、BCP、β-大马酮、β-杜松烯、反式-橙花叔醇平均质量浓度分别为0.006 3、0.107 5、0.048 7、0.008 8、0.001 6 mg/L，商品酒中GAT、BCP及反式-橙花叔醇平均质量浓度为0.006 8、0.117 5、0.001 9 mg/L。经计算，13 种牛栏山原酒中β-大马酮的平均OAV为406.25；BCP在纯水中的阈值为64.00 μg/L，其平均OAV为1.68，其余3 种萜烯化合物OAV均小于1，β-大马酮呈蜂蜜味，BCP呈苔藓味，这两种萜烯化合物可能是牛栏山二锅头原酒中重要的香气化合物。
2 体外细胞模型法评价萜烯类化合物的抗氧化活性分析结果
2.1 萜烯化合物对HepG2细胞存活率的影响
结果显示，随着GAT质量浓度的升高，细胞存活率整体呈下降趋势。当GAT质量浓度达到0.5 mg/L时，细胞存活率较空白组有显着性降低(P<0.05)，但此时细胞存活率高于80%，可视为细胞正常存活。当质量浓度不小于5 mg/L时，细胞存活率明显降低，HepG2细胞在此质量浓度下已经受到较大损伤，不可进行后续实验。综合考虑酒样中GAT质量浓度以及为了探究不同质量浓度GAT的抗氧化作用，最终选择0.005、0.025、0.05、0.5 mg/L进行后续实验。
结果显示，随着BCP质量浓度的升高，细胞存 活率整体呈下降趋势，直到BCP质量浓度达到0.5、5 mg/L时，细胞存活率较空白组显着降低(P<0.05)，但此时细胞存活率高于80%，可视为正常细胞。当BCP质量浓度不小于50 mg/L时，细胞存活率显着降低，HepG2细胞在此质量浓度下已受到较大损伤。考虑到酒样中BCP质量浓度以及高质量浓度BCP可以更准确探究其抗氧化作用，最终选择0.05、0.5、5 mg/L进行后续实验研究。
2.2 萜烯化合物对AAPH诱导的氧化损伤细胞中ROS的影响
如图3、4所示，空白组未添加AAPH及样品，细胞 产生较低的ROS，经过AAPH处理后细胞发生氧化损伤， 产生大量的ROS，荧光强度较空白组增加63.64%，经不同质量浓度GAT预处理后，细胞内ROS荧光强度分别降 低36.28%、53.03%、67.62%、72.80%，经低、中、高质量浓度BCP处理后，ROS荧光强度分别降低62.90%、74.75%、86.91%。结果表明，经不同质量浓度GAT和BCP处理后细胞内ROS荧光强度显着下降(P<0.05)，与空白组相比也有显着性差异(P<0.05)，且呈浓度依赖性，样品组细胞中ROS的荧光强度甚至低于空白组，这表明这两种萜烯化合物具有直接清除细胞内ROS、防止细胞氧化损伤的作用。
2.3 萜烯化合物对氧化损伤细胞内MDA含量的影响
如图5、6所示，与空白组相比，AAPH组细胞内MDA含量显着增加(P<0.05)。样品组与AAPH组相比显着降低(P<0.05)，GAT质量浓度由低到高各组对MDA抑制率分别为70.11%、90.75%、95.37%、97.72%；BCP质量浓度由低到高各组对MDA抑制率分别为95.14%、96.89%、98.44%。对于低质量浓度的GAT(0.005、0.025 mg/L)对细胞进行处理后，细胞内MDA水平较空白组仍显着升高。本实验中经过低质量浓度GAT和BCP处理后细胞内MDA含量都有所下降，表明这两种萜烯化合物对AAPH氧化应激HepG2细胞具有保护作用，能够维持细胞正常代谢。
2.4 萜烯化合物对氧化损伤细胞内抗氧化酶的影响
结果显示，与空白组相比，AAPH组3 种抗氧化酶的活力均显着性降低，SOD、GSH-Px、CAT活力分别降低45.88%、56.89%、66.99%，表明经AAPH处理后，细胞产生氧化损伤，激发了HepG2细胞内酶氧化应激。样品组与AAPH组相比3 种酶活力有显着性增加，不同 质量浓度GAT给药组SOD活力增加84.46%～212.46%，GSH-Px活力增加128.01%～189.99%，CAT活力增加201.47%～490.20%。值得注意的是，添加0.005 mg/LGAT后，样品组中3 种酶活力与空白组相比无显着性差异(P<0.05)，本次研究中13 种牛栏山二锅头原酒、3 种商品酒中GAT的平均质量浓度分别为0.006 34 mg/L和 0.006 8 mg/L，结果表明酒中该化合物的剂量可以使氧化损伤细胞内抗氧化酶活性恢复到正常水平。经不同质量浓度组BCP处理后，SOD活力增加120.00%～320.92%，GSH-Px活力增加124.05%~247.91%，CAT活力增加217.65%～677.45%。
牛栏山二锅头原酒及商品酒中BCP平均质量浓度分别为0.107 5、0.117 5 mg/L，该质量浓度可以显着升高氧化损伤细胞内抗氧化活力。本实验的研究结果表明GAT和BCP这两种萜烯化合物对AAPH诱导的HepG2细胞氧化损伤具有一定的防护作用，除了通过直接清除ROS自由基而发挥抗氧化作用，还通过影响细胞内抗氧化活力而发挥作用。
2.5 萜烯化合物对氧化损伤细胞中GSH浓度的影响
细胞在正常状态下，GSH浓度较高，未加样品进行保护，只加AAPH损伤处理的HepG2细胞，与空白组相比显着下降(P<0.05)，下降率达49.86%，经萜烯类化合物预处理后，细胞内GSH的浓度显着增加，且呈浓度依赖性。GAT低质量浓度组至高质量浓度组GSH浓度增加率分别为22.59%、43.67%、66.50%、83.22%，经高质量浓度组GAT(0.5 mg/L)处理后的细胞中GSH浓度与空白组仍有显着性差异，说明此时细胞的氧化损伤并未完全消除。BCP低质量浓度组至高质量浓度组GSH浓度增加率分别为66.52%、87.08%、99.92%，经高质量浓度BCP(5 mg/L)处理后的细胞中GSH浓度与空白组无显着性差异，此时细胞的氧化损伤得到抑制甚至消除。
以上结果表明，经GAT和BCP处理后的细胞能够阻止细胞内GSH水平下降，保护细胞免受AAPH诱导的氧化损伤。本实验选择与白酒中BCP、GAT的实际质量浓度相似的范围，综合多种抗氧化作用指标证明了BCP和GAT在白酒剂量水平(低质量浓度)下也发挥着较强的抗氧化作用，为中国白酒的健康发展提供了理论参考。
结 论
本研究利用HS-SPME-GC-MS技术对13 种牛栏山二 锅头酒中的GAT和BCP进行测定，其中GAT在二锅头酒 中为首次发现。按酒中剂量范围利用AAPH诱导的HepG2 细胞氧化损伤模型探究抗氧化性，研究发现GAT和BCP能够清除氧化损伤细胞内ROS、提高机体内非酶系统抗氧化剂GSH的浓度，通过提高SOD、GSH-Px、CAT的活性增强细胞内酶抗氧化系统，同时还可以防止脂质过氧化终产物MDA含量的增加，提高细胞的抗氧化能力，其抗氧化能力呈浓度依赖性增加。这一结果可为中国白酒的健康特性提供基础数据。
本研究发现GAT和BCP在牛栏山二锅头酒中的剂量下，可发挥抗氧化作用，而且此剂量水平未超过美国香料生产者协会的香料限制标准，符合食品安全法规，是一种有效的白酒抗氧化剂。白酒是中国人的日常饮品，GAT和BCP可能具有协同抗氧化作用。今后，明晰其来源及代谢途径，借助微生物调控的途径有效提高GAT和BCP在白酒中的含量，可能会更好地发挥其抗氧化性。本研究仅表明在与白酒含量相同的剂量范围内GAT和BCP单体具有抗氧化作用，但白酒这一复杂混合体系的 生理活性及作用剂量还需进一步研究。
