发酵肉制品在贮藏过程中，由于受到原料质量、pH值、微生物、酶、温度、湿度和时间等因素的影响，也存在一些潜在的安全隐患，比如亚硝酸盐和生物胺的积累，在适宜条件下会形成致癌物亚硝基化合物；虽然脂肪氧化有益于风味的产生，但是过度的氧化会产生毒素，危害人体健康，而且一般发酵肉制品都具有较高的脂肪含量，所以也极易发生脂肪过度氧化；最后还有病原菌和霉菌毒素的产生等，它们既会影响产品的 营养价值，更重要的是会危害到人体健康。
宁波大学浙江省动物蛋白食品精深加工技术重点实验室的阮一凡、潘道东*和孙杨赢等人以鸭腿肉为原料，通过对接菌量、菌种配比、发酵温度和发酵时间4 个因素进行发酵鸭腿的单因素试验和正交试验，确定其最佳工艺配比，并对终产品的大肠杆菌、过氧化值、亚硝酸盐和组胺含量进行测定，确定其安全性。然后对发酵鸭腿成品贮藏过程中感官评价、菌落总数、亚硝酸盐含量、TBARS值、TVB-N值及生物胺的变化进行测定，以期为发酵鸭腿产品贮藏品质变化提供参考及理论依据。
1 单因素试验结果
1.1 接菌量的选择
由图1可看出，随着接菌量的增加，发酵鸭腿的感官评分值呈现先增大后减小的趋势，pH值则逐渐下降，在接菌量2%和2.5%时差异不显着(P>0.05)。在接菌量为2%时，达到最大值82 分。但添加过多的发酵剂后，其发酵剂发酵产物，比如乳酸产生过多，导致产品pH值过低，影响产品接受度。综合感官评分和pH值，选择接菌量2%为最适条件。
1.2 发酵剂菌种配比的选择
由图2可知，当植物乳杆菌比例不变，随着酿酒酵母菌比例的增加，感官评分变化不显着，pH值逐渐上升。当比例为2∶3时，感官评分最高为83 分，说明植物乳杆 菌对于感官评分的影响较大，而此时产品pH值为5.27。而当比例为3∶2时，感官评分下降，选择菌种配比2∶3为最佳。
1.3 发酵温度的选择
由图3可知，随着发酵温度的升高，发酵鸭腿的感官评分呈现先升高后降低的变化趋势，pH值逐渐降低，因为温度越高，发酵会越快，pH值降低越显着。随着温度缓慢升高，感官评分的变化不显着，当温度在33 ℃时达到最大，然后开始下降。所以选取发酵温度33 ℃为最适条件。
1.4 发酵时间的选择
结果显示，随着发酵时间的不断延长，前期感官评分上升趋势快，在12～18 h期间差异不显着，而后在第24小时感官评分达到最大值，然后随着时间的延长缓慢下降，差异不显着。而pH值在6～12 h和18～24 h差异不显着(P>0.05)，后期随着时间的延长则逐渐减少。随着发酵时间的延长，乳酸菌与酵母菌相互作用，产生良好的风味物质。但时间过长也可能造成乳酸的积累导致风味不佳，后续感官评分逐渐下降。所以，选取发酵时间24 h为最适条件。
2 正交试验结果
在单因素试验基础上，根据Minitab17.0数据处理系统中的L9(34)正交试验设计方法，以菌种配比(A)、发酵温度(B)、接菌量(C)、发酵时间(D)作为4 个考察因素，选取3 个水平进行试验并对结果进行极差分析，以确定最佳工艺条件。结果显示，感官评分最优水平为A3B2C3D2；而低pH值有利于产品保存，所以最优水平为A3B2C3D3。感官评分4 个因素的影响主次顺序为：接菌量(C)>发酵温 度(B)>菌种配比(A)>发酵时间(D)，说明接菌量作用最大；而pH值4 个因素的影响主次顺序为：接菌量(C)>发酵温度(B)>发酵时间(D)>菌种配比(A)，也说明混合发酵剂的接菌量直接影响产品的pH值。
结果显示，A3B2C3D2感官评分最高，但与A2B2C3D1的差异不显着(P>0.05)，而A2B2C3D1组的pH值虽高于A3B2C3D3，但高质量发酵产品pH值应控制在4.7～5.2之间，此时的发酵产品既有利于产品保存，又不会因为过酸影响口感。所以最后确定A2B2C3D1为最优工艺组合，即菌种(植物乳杆菌-酿酒酵母菌)配比1∶2、发酵温度30 ℃、接菌量2.0%、发酵时间24 h。
发酵鸭腿理化指标测定结果
结果显示，此时接菌发酵的产品pH值为5.02，既满足了消费者对酸度的接受范围，也对产品的安全性有了保障。大肠杆菌作为判断发酵香肠安全性的重要指标之一，根据国家对发酵肉制品的要求是小于30 MPN/100 g，终产品中未检出大肠杆菌，因为发酵剂特别是乳酸菌的生长可以抑制致病菌的生成。过氧化值直接反映了脂肪氧化的程度，乳酸菌会生成乳酸从而降低pH值，当pH值小于7时，脂肪氧化的程度会随着pH值的升高而增强，所以终产品脂肪氧化程度低。亚硝酸盐作为腌制剂添加到肉中，但乳酸菌可以一定程度促进亚硝酸盐分解，降低其含量。组胺作为毒性最强的生物胺，一直在发酵肉制品中备受关注，因为发酵肉制品的蛋白含量普遍较高，随着加工和贮藏时间的延长，容易生成生物胺。由于发酵时间短，产品组胺没有检出。
4 贮藏期指标测定结果
4.1 发酵鸭腿贮藏过程中菌落总数的变化
结果显示，贮藏初期接菌组菌落总数为3.46(lg(CFU/g))，且接菌组数量明显高于对照组。接菌组鸭腿的菌落总数在贮藏过程中呈现先增多后减少的趋势，从第0天的3.46(lg(CFU/g))上升到第20天的4.42(lg(CFU/g))，之后开始下降，到第50天为3.22(lg(CFU/g))，且40 d和50 d没有显着差异，可能是间隔时间短，菌落总数变化量不大。
4.2 发酵鸭腿贮藏过程中感官评分的变化
结果显示，第0天接菌组的感官评分为84.7，不接 菌组的感官评分为79.66。在贮藏过程中接菌两组发酵鸭腿的产品感官评分逐渐降低，但是接菌发酵组的评分一直高于不接菌组。而且不接菌组的发酵鸭腿在第20天时感官评分为61.71，在第30天已经低于60 分，鸭肉已经 散发出不好的腐败气味，从菌落总数指标也可以看出，在第30天时，不接菌组的菌落总数已经大于106 CFU/g，所以这种不好闻的气息可能来源于微生物引起的质量劣变，影响了感官评分，后续没有对不接菌的鸭腿进行感官的评分。而接菌组在第50天感官评分仍为67.54。
4.3 发酵鸭腿贮藏过程中亚硝酸盐的变化
结果显示，在贮藏期间发酵鸭腿的亚硝酸盐含量在第20天达到最大值，随后逐渐减少。而不接菌发酵鸭腿在贮藏过程中持续增加，但50 d内亚硝酸盐含量始终低于30 mg/kg，符合GB2760—2014《食品添加剂使用标准》的规定。在常温下，微生物活动活跃，以引起食物腐败的G+ 细胞(如肉毒核状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等)腐败 菌繁殖加快，产生毒素导致蛋白质易分解，蛋白质分解产生大量的胺类物质。此时形成的亚硝胺数量更多，从而不接菌组的亚硝酸盐含量会持续增加。而接菌组中的乳杆菌逐渐成为优势菌群从而抑制腐败菌的生成，所以会抑制亚硝酸盐的生成。
4.4 发酵鸭腿贮藏过程中TBARS值的变化
产品中TBARS值在0.5～1.0 mg/kg时不会产生腐败气味，小于1.0 mg/kg的产品是可以接受的。结果显示，随着贮藏时间的延长，接菌组发酵鸭腿的TBARS值从初始的0.49 mg/kg逐渐增加至第50天的0.63 mg/kg，增长的幅度较小。而且因为植物乳杆菌可以产生乳酸，导致pH值的下降，抑制脂肪的氧化，所以接菌处理对TBARS具有抑制作用。而不接菌组从初始的 0.65 mg/kg到1.27 mg/kg，在第30天的含量已经高达0.85 mg/kg，说明接种发酵剂可显着影响并延缓发酵鸭腿的脂质氧化。TBARS值达到1~2 mg/kg以上就已腐败变质。
4.5 发酵鸭腿贮藏过程中TVB-N值的变化
TVB-N值小于15 mg/100 g为一级鲜度，在15～20 mg/100 g之间为二级鲜度，大于20 mg/100 g为变质肉。结果显示，接菌组发酵鸭腿TVB-N值从初始 2.61 mg/100 g到50 d的14.98 mg/100 g，不接菌组从初始的2.30 mg/100 g到50 d的34.02 mg/100 g，TVB-N值在整个贮藏过程中持续增加，但接菌组中TVB-N值增加缓慢，且都低于15 mg/100 g。结果表明，接种混合发酵剂 可有效抑制TVB-N的生成，提高发酵香肠的卫生质量。
4.6 发酵鸭腿贮藏过程中生物胺含量的变化
生物胺混标色谱见图10。结果显示，除尸胺外，其他接菌组的生物胺都是呈现先上升后下降的趋势，而不接菌组的生物胺含量一直呈现出上升趋势。通过发酵为生物胺的形成创造了适当条件，包括微生物生长和蛋白质水解。在贮藏前期，微生物的存在及发酵产品成熟过程中微生物脱羧酶的残留活性，水解形成的游离氨基酸作为 胺的潜在前体，都会增加生物胺含量。
从图5可以看出，从30 d开始菌落总数开始下降。细菌在贮藏期间的生长受到贮藏温度、含氧量、氯化钠含量等的影响。而由于大部分与组胺产生有关的细菌为嗜温菌，所以前期没有组胺产生，而后期产生可能是因为室温下组胺易形成。而接菌组的生成组胺含量少于不接菌组，说明混菌发酵可以有效控制发酵肉中组胺的积累。
结 论
本实验在传统发酵产品的基础上，引入新的发酵工艺制备发酵鸭腿，并研究其品质特性的变化规律，得到的发酵鸭腿产品发酵风味浓郁，品质良好。通过对接菌量、菌种配比、发酵温度和发酵时间这4 个因素进行单因素试验和正交试验，得到发酵鸭腿的最佳工艺条件为接菌量2%、植物乳杆菌-酿酒酵母菌菌种配比1∶2、发酵温度30 ℃、发酵时间24 h，通过对此工艺下制作的发酵产品pH值、大肠杆菌、亚硝酸盐、组胺和过氧化值测定，得到产品的指标均在国家标准要求范围内，说明此工艺条件下制得的发酵鸭腿具有较高的感官评分和较好的安全性。在常温贮藏过程中，真空包装的发酵鸭腿其菌落总数和亚硝酸盐含量呈先增加后降低的趋势，TBARS值和TVB-N值始终在缓慢增加，整体的变化范围较小。酪胺、精胺与腐胺是贮藏期间检出的主要胺类物质，接菌组生物胺含量在贮藏期间的后期有所下降，不接菌组生物胺含量初期较低，后期持续升高。不接菌组于30 d因微生物质量劣变引起不好的风味，而接菌组将产品贮藏期延长至50 d。所以添加混合发酵剂能够提升产品口感和延长产品贮藏期，为新型发酵产品的生产提供了新的方向和理论指导。
