α-LA是母乳中的生物活性蛋白之一。它能为婴儿提供丰富的必需氨基酸，如色氨酸和半胱氨酸，并促进矿物质吸收；参与乳糖合成以促进乳的分泌；其熔球状态能抗病毒感染并促进癌细胞凋亡。在婴儿配方奶粉中补充α-LA对于婴儿的生长发育意义重大。探究α-LA在婴儿配方奶粉中的适宜添加量，在保证其最大程度的发挥生物活性的同时减少用量，意义十分重大。
在前期体外实验中，探究不同添加量的α-LA对肠道益生菌和有害菌的增殖或抑制作用，以此为基础，参考母乳中α-LA添加量，东北农业大学食品学院的李梦寒、许晓曦*和马春丽*以及黑龙江农业工程职业学院的王志勇等人通过本实验再次筛选出高添加量α-LA（200 mg/kg）、中添加量α-LA（100 mg/kg）、低添加量α-LA（20 mg/kg）3 个剂量，以SD大鼠为动物模型，采用16S rRNA测序技术探讨α-LA对肠道菌群多样性及物种组成的影响，重点分析不同添加量α-LA对肠道益生菌、潜在有害菌的促进或抑制作用，从而选择出调节婴儿肠道菌群的最佳添加量，为进一步的婴儿喂养实验提供研究基础，最终为婴儿配方奶粉中α-LA科学的添加量提供理论支持。
一、大鼠肠道菌群多样性分析
1.1 α多样性分析
本实验以稀释性曲线、物种数目饱和度曲线、α多样性指数3 个角度评估α多样性。稀释性曲线是基于OTU聚类结果利用mothur做稀释性分析，利用R语言工具制作的曲线图。它可以用来评估样本的测序数据量是否合理，也可以用来比较不同样本的物种丰富度。
由图1可知，大鼠肠道菌群的稀释曲线随样品序列数目增加趋于平坦，说明测序数据量足够大，更多的数据量只会产生少量新的OTU，测序结果可以反映样本中绝大多数的微生物信息。在测序深度相同的情况下，B4、B6、C5、B5、C4的丰富度明显高于其他样品，说明第28天时高添加量组、中添加量组提高了大鼠菌群的丰富度。
由图2可知，24 个样品的曲线趋势相似。在水平方向上，各样品曲线宽度反映丰富度，曲线在横轴上的范围较大，体现出不同样品的物种丰度可能有较大差异，其中B4、B5丰富度最高，A2、A3丰富度最低。另一方面，曲线形状反映了样本中物种的均匀度，图中各个样品曲线平滑程度较好，仅末端有部分曲折，整体趋势平缓，说明物种分布均匀。
由图3可知，Chao1指数、Observed species指数、Shannon指数、PD whole tree指数变化趋势相似。在大鼠饲喂第14天时，各多样性指数柱形图几乎持平，不同添加量的蛋白对提高大鼠粪便菌群α多样性效果不显着（P＞0.05）；饲喂第28天时，高添加量组、中添加量组各多样性指数均高于对照组，在Shannon指数中，高添加量组多样性显着高于对照组（P＜0.05）。低添加量组多样性与对照组无显着差异（P＞0.05）。说明第14天时各蛋白浓度组不能提高菌群多样性，第28天时高添加量、中添加量蛋白发挥出生物活性，显着提高了大鼠肠道菌群的丰富度和均匀度。
1.2 β多样性分析
由图4可以看出，在大鼠饲养第14天时，每组内各个样品点分布区域比较密集，样品个体差异性较小，每组内3 个样品微生物群落结构相似，平行度较好。AA、BA、CA、DA各组形成的圆圈两两均有交集，说明组间差异性较小，此时不同添加量的α-LA对肠道菌群的群落结构无显着影响。饲养第28天时，AB、DB两组所形成的圆圈面积小，样品平行度好，BB组、CB组稍差，这可能与大鼠的个体差异相关。第28天时各组的圆圈交集较少，群落组成出现差距，此时α-LA发挥出了生物活性，对肠道菌群群落结构产生影响，使实验组与对照组区分显着。
综合α多样性和β多样性分析可知，本实验测序量足够大，结果可以反映样本中绝大多数的微生物信息。在大鼠饲喂第14天时，各组AA、BA、CA、DA在丰富度、均匀度、群落结构上均无显着差异，此时各蛋白添加量组并未完全发挥生物活性；在饲喂第28天时，BB（P＜0.05）、CB（P＞0.05）组的多样性明显提高，群落结构与对照组AA组相比差距很大，此时α-LA完全发挥出了生物活性，它对于肠道菌群的调整是一个温和的渐进过程。
二、物种组成分析
2.1 基于门分类水平的分析
探究不同添加量的α-LA对门水平上肠道菌群组成的影响，结合图5可知，各组样本生成的OTU主要由5 个门构成：厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、放线菌门（Actinobacteria）、变形菌门（Proteobacteria）、疣微菌门（Verrucomicrobia），其中厚壁菌门和拟杆菌门占绝对主导地位。
此外，由图6可以看出，其他相对丰度较高的门还有柔膜菌门（Tenericutes）、蓝菌门（Cyanobacteria）等。第28天时BB、CB组出现了浮霉菌门（Planctomycetes）、绿湾菌门（Chioroflexi）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）、醋酐菌门（Acidobacteria）、装甲菌门（Armatimonadetes）、异常球菌-栖热菌门（Deinococcus-Thermus）、硝化螺旋菌门（Nitrospirae）等新菌门，说明高添加量α-LA和中添加量α-LA在第28天时有效提高了大鼠肠道菌群的多样性，与上述α多样性分析相符合。
2.2 基于属分类水平的分析
由图7可知，乳杆菌（Lactobacillus）、瘤胃菌科（Ruminococcaceae）下的未知属Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_1、阿克曼氏菌（Akkermansia）、木质真菌（Eubacterium xylanophilum group）、毛螺旋菌科（Lachnospiraceae）下的未知属Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Marvinbryantia、布劳特氏菌（Blautia）、梭菌科下的未知属Clostridium sensustricto_1、普氏菌科（Prevotellaceae）下的未知属（Prevotella_9、Prevotella_1、Prevotellaceae_UCG-001）、拟杆菌（Bacteroides）等为大鼠肠道中相对丰度较高的菌属。比较第14天与第28天时的热图发现，第14天时各样本微生物主要分布在特定的几种属上，其余属分布丰度较低，而第28天时大量属的丰度均有提高，样本分布均匀度提高，这再次印证了上述α多样性分析。
由图8可知，灌喂α-LA会影响大鼠肠道菌群属水平上的组成。实验结果显示，第28天时中添加量、低添加量蛋白使乳杆菌相对丰度分别提高9.89%、26.29%，而高添加量蛋白使其丰度下降3.29%。乳杆菌是一种优质的益生菌。第28天时蛋白添加量由高到低分别使木质真菌相对丰度提高0.31%、0.18%、0.45%；高添加量蛋白降低布劳特氏菌的相对丰度，而中、低添加量蛋白维持或提高其相对丰度；各蛋白添加量组均能维持毛螺旋菌科成员Lachnospiraceae_NK4A136_group、Lachnospiraceae_UCG-006、Marvinbryantia以及梭菌科下的未知属Clostridiumsensu stricto_1相对丰度保持恒定。
第14天时高添加量蛋白降低阿克曼氏菌的相对丰度，中、低添加量蛋白对其有一定的促进作用。对于瘤胃球菌科成员Ruminococcaceae_UCG-014、Ruminococcaceae_UCG-005、Ruminococcus_1，各蛋白组有维持其相对丰度的趋势。阿克曼氏菌和瘤胃球菌科在长寿老人粪菌中相对丰度均较高，可能成为长寿信号之一。此外，α-LA可降低普氏菌科成员相对丰度，蛋白添加量由高到低分别使普氏菌科下的未知菌属Prevotella_9丰度下降2.01%、2.26%、2.3%；使普氏菌科下的未知菌属Prevotellaceae_UCG-001相对丰度下降3.89%、3.97%、4.26%。
在本实验中，不同添加量的α-LA起到了与母乳相似的作用，它同样促进肠道优势益生菌的繁殖，并抑制肠道有害菌的生长。从益生菌的角度分析，中、低蛋白组提高了益生菌乳杆菌、布鲁克士菌、阿克曼士菌相对丰度，而高添加量蛋白组作用相反；高、中、低蛋白组均能提高木质真菌并维持瘤胃球菌科成员、毛螺旋菌科成员、梭菌科下的未知属Clostridium sensu stricto_1相对丰度保持恒定。从有害菌角度分析，α-LA使普氏菌科成员、拟杆菌属相对丰度有不同程度的降低，作用效果随浓度降低而提高；对有害菌大肠杆菌-志贺菌属体现出极强的抑制作用，中添加量组抑制效果最好，将其相对丰度由1.90%降至0.01%。由此可知，不同添加量的α-LA均能维持或促进肠道益生菌繁殖，中、低添加量蛋白效果更好；对肠道中潜在有害菌起到抑制作用，高、中添加量蛋白效果更好。
结 论
经实验探究，中添加量α-LA（100 mg/kg）为调节肠道菌群的最佳添加量，主要实验结论如下：1）第14天时不同添加量的α-LA对大鼠肠道菌群的多样性无明显影响，第28天时高添加量蛋白组、中添加量蛋白组在提高物种多样性的同时兼顾了均匀性。第14天时各浓度组聚集成团，交叉区域范围广，区分不明显；第28天时各组圆圈交集较少，实验组与对照组区分显着，蛋白对群落结构产生影响。大鼠肠道菌群以厚壁菌门和拟杆菌门为主，各浓度蛋白组对于门水平的调节与母乳相似。中、低蛋白组能提高乳杆菌、布劳特氏菌、阿克曼氏菌的相对丰度；各浓度组均能使普氏菌科成员、拟杆菌相对丰度有不同程度的降低，作用效果随浓度降低而提高；各浓度组均能提高木质真菌相对丰度并维持瘤胃球菌科成员、毛螺旋菌科成员、梭菌科下的未知属相对丰度保持恒定。2）中添加量α-LA能在提高菌群多样性的同时温和的提高益生菌相对丰度，降低潜在有害菌的相对丰度，有利于长期维持肠道的健康。本实验结果可为婴儿喂养实验提供参考值，最终为婴儿配方奶粉中α-LA科学的添加量提供理论支持。
