双歧杆菌作为一种重要的肠道有益微生物，对婴幼儿的健康发挥着重要的作用，因此分离得到可以在肠道内定植的益生双歧杆菌具有非常重要的应用价值和现实意义。石河子大学食品学院的魏小晶、周桓丞、倪永清*和张艳*等人旨在从喀什地区婴幼儿肠道粪便中分离鉴定双歧杆菌，对其遗传差异进行分析，并从中分离筛选具有潜在益生特性的双歧杆菌菌株，以期为开发适应人体肠道的高活性益生双歧杆菌及为其他益生菌产品的研发奠定相关理论基础。
一、双歧杆菌的分离与鉴定
从不同来源的26 份婴幼儿粪便中共分离得到180 株纯培养物，经镜检菌落形态、革兰氏染色及过氧化氢酶实验初步确定疑似双歧杆菌。通过双歧杆菌属间鉴定，进一步对其进行16S rRNA基因测序。测序所得序列经BLAST同源性比对后最终确定有75 株为双歧杆菌。其中长双歧杆菌婴儿亚种（B. longum subsp. infantis）33 株，长双歧杆菌猪亚种（B. longum subsp. suis）8 株，两歧双歧杆菌（B. bifidum）19 株，假小链双歧杆菌（B. pseudocatenulatum）10 株，青春双歧杆菌（B. adolescentis）5 株。
二、双歧杆菌遗传差异性分析
根据rep-PCR指纹分型技术，从同种指纹带型相同的菌株中挑选2～4 个典型菌株，共得到27 株代表性双歧杆菌，采用Gel Compar II软件将两种不同引物对应的指纹图谱进行聚类。由BOXAIR-PCR和(GTG)5-PCR指纹聚类图（图1）可以清晰看出，27 株双歧杆菌的指纹图谱带型较丰富，能够反映菌株在种水平上的遗传差异。
BOXAIR-PCR扩增产物的大小在300～5 000 bp之间，包括3～8 个明显的亮带，并有一些弱带；(GTG)5-PCR指纹图谱也在300～5 000 bp范围内并有1～10 个相对明显的条带，大多数产物的条带数在5 条以上。由图1可知，27 株代表性双歧杆菌根据指纹相似性被聚为4 群，Cluster I由3 株B. longum subsp. suis和11 株B. longum subsp. infantis组成，在3 株B. longum subsp. suis中菌株f65-5和f65-1带型相似，而菌株f65-6的带型与它们相差较大，其中11 株B. longumsubsp. infantis有4 种带型；ClusterII由6 株B. bifidum构成，菌株f107-11、f107-7和f105-15带型相似，但明显不同于其他3 个菌株，存在2 种带型；ClusterIII由5 株B. pseudocatenulatum组成，其中菌株f115-8和f40-16带型相似，菌株f40-15的带型与它们相差较大，尤其是BOXAIR-PCR扩增的指纹图谱条带更为明显；Cluster IV由2 株带型相似B. adolescentis组成。27 株双歧杆菌种间具有明显差异，遗传多样性较丰富。
三、益生特性分析
3.1 抑菌活性分析
采用牛津杯法检测27 株双歧杆菌对常见致病菌的抑菌活性，结果显示，实验菌株中有16 株双歧杆菌发酵上清液具有较好的抑菌性能，均可以抑制致泻大肠埃希氏菌CICC10411、出血性大肠埃希氏菌CICC 21530、鼠伤寒血清型肠沙门氏菌肠亚种CICC 10420和血清型肠炎沙门氏菌肠亚种CGMCC 1.10754；其中B. longum subsp. infantis中菌株f65-26、f115-9、f107-6、f77-16和f77-11的抑菌性能较好；在B. longum subsp. suis中菌株f65-5、f65-1的抑菌能力较强，具有广谱抑菌性；在B. bifidum中菌株f107-7和f105-15可以抑制本实验中所有的肠道致病菌；相对而言，B.adolescentis菌株抑菌能力很弱。
3.2 抑菌双歧杆菌菌株系统发育树分析
将具有较好抑菌活性的16 株双歧杆菌的部分16S rRNA基因序列与GenBank数据库中已知的16S rRNA基因序列进行同源性比对，选取序列相似度高的菌株构建系统发育树见图2，由系统发育树可知，16 株双歧杆菌被划分为3 个分支。其中B. longumsubsp.infantis和B. longumsubsp.suis亲缘关系较近，分布在同一个大分支上；B. pseudocatenulatum和B. bifidum各自构成一个独立的大分支，相似度分别达到99%和100%。
3.3 抑菌双歧杆菌的碳源代谢分析
对16 株双歧杆菌进行14 种糖发酵实验，碳源代谢结果使用NTSYS-pc 2.01软件进行系统聚类（图3）。根据糖发酵代谢情况，在70%相似性水平可以将双歧杆菌菌株聚为3 类，其中菌株f65-5和f65-1聚在一起，碳源代谢情况相似；在4 株B. bifidum中菌株f40-5的碳水化合物利用能力与菌株f107-11、f107-7、f105-5存在明显差异，这与图1中菌株指纹差异相对应，对于基因型相同的菌株，碳源代谢能力基本相同；B. longumsubsp.infantis中菌株f115-9和f65-26的碳源利用情况存在明显差异，且菌株f115-9可以代谢9 种碳源，碳源利用率较高，尤其菌株f107-6和f77-11可以利用10 种碳源；B. pseudocatenulatum中菌株f115-8和f40-16碳源利用情况相同。16 株双歧杆菌均可以代谢葡萄糖、乳糖、蔗糖和半乳糖。
3.4抑菌双歧杆菌菌株对酸及胆盐的耐受性
结果显示，所有菌株在pH 4.0、5.0、6.0的PBS中均能存活，而在pH 3.0的PBS中仅有菌株f65-26、f40-15和f115-8能够存活，其具有较强的耐酸能力。实验中多数菌株能够在0.3%的胆盐中存活，当胆盐质量分数为0.5%时，仅有菌株f65-26和f115-8存活率分别达到24.11%和27.06%，当胆盐质量分数为1.0%时，几乎所有菌株存活率低于0.000 1%，相对而言，菌株f40-15在pH 3.0的PBS中存活率较好，而在0.5%的胆盐中几乎不能存活。根据菌株耐酸耐胆盐的整体结果来看，菌株f65-26和菌株f115-8为耐受性最优菌株。
四、抗生素耐药性分析
从图4可知，16 株抑菌双歧杆菌对大多数抗生素表现敏感，而深绿色区域主要集中在阿米卡星和万古霉素，由美国临床实验室标准化委员会标准CLSI判断表明，除菌株f107-6和f65-26分别对万古霉素和阿米卡星表现敏感外，其余所有实验菌株对这两种抗生素表现耐药；其中部分菌株对庆大霉素也表现耐药；在青霉素类抗生素中，所有双歧菌株对青霉素和氨苄西林敏感，相对苯唑西林而言，除菌株f77-16对苯唑西林表现敏感外，所有菌株对其表现中敏或耐药，可见同种抗生素耐药情况也不相同。
讨 论
本实验结合分子生物学及传统菌株的分离鉴定方法，从26 份新疆维吾尔族婴幼儿粪便中共分离得到75 株双歧杆菌，其中B. longum subsp. Infantis 33 株，B. longum subsp. suis 8株，B. bifidum 19 株，B. pseudocatenulatum 10 株，B. adolescentis 5 株。为准确反映双歧杆菌菌株间的遗传多样性，本研究采用(GTG)5和BOXAIR两种不同引物的rep-PCR指纹图谱技术对筛选到的双歧杆菌进行遗传差异性分析，发现这些菌株种间具有明显的差异，种内带型多样，存在极高的遗传多态性。
本实验采用牛津杯法对从新疆喀什地区维吾尔族婴幼儿肠道中分离得到的双歧杆菌菌株进行抑菌活性检测，发现有16 株双歧杆菌对6 种肠道致病菌具有明显的抑菌活性，从系统发育来看，其中7 株属于B. longum subsp. infantis、4 株属于B. bifidum、3 株属于B. pseudocatenulatum、2 株属于B. longum subsp. suis。这些具有良好抑菌性能的双歧杆菌在人体发挥益生特性必须要具备一定的耐受能力，本实验对抑菌性能较好的菌株进行耐酸耐胆盐实验发现B. longum subsp. Infantis f65-26和B. pseudocatenulatum f115-8分别在pH 3.0和胆盐质量分数为0.5%的培养液中存活率较高，具有较好的耐受性，后期对这些潜在益生性菌株进行体内实验是非常关键和必要的。
本研究采用纸片扩散法对16 株具有抑菌活性的双歧杆菌进行10 种抗生素敏感性测定，结果发现实验菌株除对阿米卡星及万古霉素表现耐药外，对其他抗生素均表现敏感或中度敏感，这些婴幼儿肠道中双歧杆菌抗生素耐药问题可能是双歧杆菌本身具有耐药基因存在于其染色体上，也可能是婴幼儿及母亲在饮食或生活环境中接触了相关抗菌药物。因此在今后实验中将探明其耐药机理及耐药基因的转移问题，为进一步选育安全的益生双歧杆菌菌株提供一定参考研究基础。
结 论
本研究从新疆喀什地区维吾尔族婴幼儿肠道中分离筛选得到75 株可培养的双歧杆菌菌株，并通过rep-PCR指纹分型技术对菌株遗传结构差异进行分析。此外，对代表性双歧杆菌菌株进行抑菌、耐酸耐胆盐及抗生素耐药性实验发现，有16 株双歧杆菌菌株具有良好的抑菌性能并对多数抗生素表现敏感，尤其是B. longumsubsp.Infantis f65-26和B. pseudocatenulatumf115-8为耐受性最优菌株，具有潜在的开发利用价值。
