常采用巴氏杀菌法对液态蛋进行杀菌处理，巴氏杀菌的温度一般在60 ℃左右，该温度可能会对鸡蛋中的热敏性组分产生较大的影响，从而影响鸡蛋的起泡性、乳化性等功能性质。为了解蛋清蛋白在热处理中结构的变化，有必要阐明蛋白质分子间的相互作用，然而蛋清含有数百种蛋白质，成分复杂，多种蛋白质的相互作用无法明确进行分析，所以本实验选择了蛋清中卵白蛋白和溶菌酶2 种重要蛋白进行研究，期待为进一步探索提供工作基础。
南昌大学食品科学与技术国家重点实验室的汪吴晶、佟平和南昌大学食品学院的高金燕*等人采用离子交换层析方法分离纯化出卵白蛋白（OVA）和溶菌酶（Lys），在不同的加热条件下对OVA、Lys及OVA-Lys混合物进行处理，采用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）对蛋白质分子质量进行表征，用浊度、溶解度对蛋白质物理性质进行分析，通过圆二色光谱、紫外光谱、荧光光谱表征热加工对蛋白质结构的影响，并通过酶联免疫吸附测定（ELISA）研究相互作用后的蛋白质致敏性的变化。旨在确定不同温度处理下（25、60、65、70 ℃）OVA和Lys相互作用对其结构和致敏性的影响，为开展后续工作提供依据。
1. OVA、Lys、OVA-Lys的溶解度和浊度变化
利用BCA试剂盒对不同温度处理下的OVA、Lys、OVA-Lys的溶解度进行分析。结果显示，OVA在70 ℃加热后溶解度有显着性降低，但仍在90%以上，可能形成了极少量不溶性聚合物，在60、65 ℃加热下溶解度无显着性变化。Lys单体在60、65 ℃与常温相比溶解度无显着性变化，而70 ℃加热后溶解度显着性降低。OVA-Lys在60、65 ℃混合加热后溶解度有下降的趋势，但与单体加热相比溶解度未呈现显着性变化，说明OVA和Lys混合物加热溶解度下降的主要原因是受温度影响，但在70 ℃溶解度与单体相比显着降低，降为84%，说明在70 ℃条件下OVA和Lys会形成部分不溶性聚合物。
对不同温度处理下的OVA、Lys、OVA-Lys的浑浊程度进行分析。结果显示，OVA和Lys单体随着温度的升高浊度呈上升趋势，且在70 ℃加热与常温相比均有显着性变化，说明70 ℃加热能使其形成了少量聚合物。OVA-Lys在60、65 ℃条件下混合加热后浊度有上升的趋势，但与单体加热相比浊度未呈现显着性变化，说明OVA和Lys混合物加热浊度上升主要是受温度影响，而两者并未发生明显的作用使浑浊程度增大。但在70 ℃条件下浊度与单体相比显着升高，说明在此温度下OVA和Lys能相互作用形成了大分子聚合物。浊度和溶解度的变化可以初步判断OVA和Lys能在70 ℃条件下发生较明显的相互作用导致物理性质的改变。且对比浊度变化结果，随着浊度的上升，可溶性蛋白含量下降，说明在热处理过程中蛋白质溶液中由于不溶性沉淀的形成可以造成蛋白溶液浊度的上升。
2. OVA、Lys、OVA-Lys的还原型和非还原型SDS-PAGE
利用还原型和非还原型SDS-PAGE对不同温度处理下的蛋白质样品进行分析。结果显示，对于OVA单体而言，非还原状态下有较多的OVA的二聚体，在还原状态下二聚体基本消失，说明OVA可以通过二硫键结合形成二聚体，而温度对卵白蛋白单体的影响不大。对于Lys单体而言，在各温度下还原和非还原条带类似，说明温度对其分子质量影响不大。对于OVA-Lys的混合物而言，25、60、65 ℃条件下的蛋白样品条带基本一致，且是单体OVA和单体Lys条带的叠加，但在70 ℃条件下，非还原型SDS-PAGE中的Lys条带消失，且泳道口有少量聚集物，而在还原型电泳中Lys条带仍然清晰可见，说明在70 ℃时Lys会与OVA结合，并且是通过二硫键结合。
3. OVA、Lys、OVA-Lys的结构分析
对不同温度处理下的OVA、Lys、OVA-Lys 的三级结构进行分析如图4所示。OVA在25、60、65 ℃条件下图谱基本相同，说明在此温度下卵白蛋白单独加热三级结构未发生明显变化，而在70 ℃条件下最大吸收光谱明显增大，说明在70 ℃条件下蛋白质展开程度变大。Lys在25、60、65、70 ℃条件下图谱基本相同，说明在此温度下Lys单独加热三级结构未发生明显变化。
OVA-Lys混合物在25、60、65 ℃条件下的图谱基本一致，说明OVA-Lys混合物在此温度下结构发生明显变化，但在70 ℃条件下加热10 min后图谱有轻微的蓝移，说明OVA-Lys的芳香族氨基酸残基的微环境极性发生改变，蓝移说明残基移向亲水的环境；另一方面OVA-Lys 的最大吸收峰较单体而言明显增强，可能是由于OVA和Lys在70 ℃相互作用后蛋白的展开程度进一步变大，从而导致色氨酸和酪氨酸残基暴露在蛋白质分子表面。
由图5可知，OVA和Lys都具有典型的α-螺旋和β-折叠结构。对蛋白的二级结构进行分析，与未加热OVA 相比，60、65、70 ℃加热后的OVA β-转角均有显着性提高，但只有在70 ℃加热的OVA无规卷曲含量显着增大，说明70 ℃条件下OVA分子逐渐由有序变得无序。与未加热Lys 相比，70 ℃加热后的Lys无规卷曲含量显着增大，说明Lys分子在70 ℃条件下由有序变得无序，而其他温度下无明显变化。OVA-Lys在加热后α-螺旋、β-折叠、β-转角含量无显着性变化，但在70 ℃无规卷曲程度变大，说明在70 ℃条件下分子向无序方向发展。
利用外源性荧光光谱对不同温度处理下的OVA、Lys、OVA-Lys的疏水性进行分析如图6所示。OVA单体随着温度的变化其荧光强度变化不大只有轻微上升。Lys单体随着温度的升高，荧光强度少量增加，且在70 ℃条件下荧光强度最大，说明其随着温度升高疏水性变大，且70 ℃条件下疏水性最大。OVA-Lys混合物在60 ℃条件下荧光强度无明显变化，65 ℃加热后荧光强度有少量增加，70 ℃条件下荧光强度增加幅度较大，说明OVA-Lys在65、70 ℃加热后疏水性增大。但OVA-Lys在65 ℃条件下与单体的形状类似，而70 ℃条件下OVA-Lys荧光强度较单体有较明显的上升，说明OVA-Lys在65 ℃条件下荧光强度变大可能只是因为温度的影响，而70 ℃条件下OVA-Lys荧光强度上升不仅受到温度的影响，同时两者能相互作用促使疏水基团暴露。
4. OVA、Lys、OVA-Lys的免疫原性
利用竞争ELISA对不同温度处理下的OVA、Lys对OVA、Lys、OVA对Lys的免疫原性进行分析。结果显示，OVA、Lys单体随着温度的升高免疫原性显着降低，说明加热能破坏OVA、Lys的IgG结合位点。对于复合物而言，随着温度的升高OVA-Lys的免疫原性有显着性降低，且温度越高复合物的免疫原性越低。60、65 ℃条件下OVA-Lys复合物与OVA单体相比，其免疫原性并没有显着降低（P＞0.05），说明在60、65 ℃条件下OVA与Lys相互作用后并没有降低OVA的免疫原性。在70 ℃条件下OVA-Lys复合物较OVA单体而言，其免疫原性显着降低（P＞0.05），说明OVA与Lys在70 ℃条件下相互作用可以降低OVA的免疫原性。
类似地，60、65 ℃条件下OVA与Lys相互作用后也没有降低Lys的免疫原性，70 ℃条件下OVA与Lys相互作用可以降低Lys的免疫原性，说明OVA和Lys在70 ℃相互作用后能相互影响蛋白的免疫原性，说明其相互作用的位点可能在IgG结合位点上。
5. OVA、Lys、OVA-Lys的致敏原性
利用竞争ELISA对不同温度处理下的OVA单体、Lys单体、OVA-Lys的致敏原性进行分析，结果如图8所示。图8A显示，OVA单体在70 ℃加热10 min后致敏原性显着降低（P＜0.05），说明70 ℃加热能破坏OVA的IgE结合位点，而60、65 ℃对OVA的致敏原性没有显着影响（P＞0.05）。图8B显示，Lys单体在加热的情况下致敏原性无明显变化，说明加热并没有显着影响Lys的致敏原性（P＞0.05）。与25 ℃相比较，由图8C、D可知，65、70 ℃条件下OVA-Lys复合物的致敏原性呈下降趋势，说明较高温度热处理能降低OVA-Lys的致敏原性；60、65 ℃条件下OVA-Lys复合物与单体相比，其致敏原性并没有显着降低，说明在此温度下OVA与Lys相互作用后并没有降低OVA或Lys的致敏原性。但在70 ℃条件下，与单体相比，OVA-Lys复合物的致敏原性显着降低，说明OVA与Lys在70 ℃条件下相互作用可以影响对方的潜在致敏性。
讨 论
本研究从蛋白质结构方面对OVA和Lys相互作用进行了分析，结果表明70 ℃热处理可以导致OVA三级结构展开，无规卷曲程度变大，分子由有序结构向无序方向发展，从而导致OVA和Lys之间的巯基相互反应产生二硫键，形成不溶性聚合物，导致溶液变浑浊，而且还原型和非还原型电泳图也证明了该结果。因此，OVA和Lys在70 ℃条件下能通过二硫键相互作用。
在60、65 ℃条件处理下，OVA和Lys的三级结构并没有展开，只有轻微的二级结构变化。因此，无法通过二硫键进行结合。另一方面，由于在生理pH值下，Lys带正电荷，而OVA带负电荷，所以两者可以自发地通过静电相互作用进行反应，且温度越高，反应程度越大。所以OVA和Lys能在70 ℃发生显着的相互作用主要是因为OVA在70 ℃条件下结构展开，疏水基团暴露，从而会与Lys通过静电相互作用以及二硫键相互作用进行结合。
本研究在25、60、65、70 ℃对蛋白质水浴加热10min，选取10 min进行处理主要是因为各国对蛋清巴氏杀菌的时间并没有统一的标准，而10 min完全满足巴氏杀菌的要求。研究发现OVA在60 ℃和65 ℃加热条件下致敏原性并没有明显变化，可能是因为在较低的温度以及较短时间内OVA结构并没有展开，抗原性没有明显变化；而70 ℃条件下分子结构展开，疏水基团暴露，可能使部分过敏原表位被掩埋或破坏，所以致敏性有所降低。而Lys在热加工处理后免疫原性有所降低，说明随着Lys疏水基团的暴露，其IgG结合位点可能被掩埋或被破坏。而致敏原性并没有显着变化，说明其在疏水基团暴露的情况下IgE结合位点可能并没有暴露、掩埋或破坏。
OVA单独加热时，70 ℃条件下无规卷曲程度变大，三级结构展开，疏水基团暴露，免疫原性降低，潜在致敏性降低，而在60、65 ℃条件下变化不大。Lys单独加热时，随着温度的升高无规卷曲程度变大，且疏水基团有所暴露，免疫原性随着温度升高而降低，但潜在致敏性无明显变化。OVA在70 ℃条件下结构展开，疏水基团暴露，从而会与Lys通过静电相互作用以及二硫键相互作用进行结合，使其浊度显着增加，溶解度显着降低。而且在70 ℃条件下由于OVA和Lys相互作用可以使OVA的免疫原性和致敏原性显着降低，同时也能使Lys的免疫原性和致敏原性显着降低，说明两者在70 ℃条件下能相互作用的位点可能在致敏表位上，从而使蛋白质的潜在致敏性得到有效的降低。而60、65 ℃条件下两者相互作用不明显。
结 论
OVA-Lys在60、65 ℃条件下加热10 min后不会显着影响彼此的结构以及潜在致敏性，而在70 ℃条件下，由于OVA的三级结构的展开，Lys疏水基团的暴露，两者会通过二硫键相互作用从而显着降低彼此的潜在致敏性。蛋清蛋白质的相互作用会影响蛋白质的结构，从而对蛋白质的致敏性产生影响，而结构的变化也会影响到蛋白质的其他功能性质，所以通过了解蛋清中主要蛋白质的相互作用可以为蛋清蛋白在热处理过程中功能性质的变化提供一定的理论基础。未来也将进一步关注蛋清蛋白的其他组合，从而更详细地了解在巴氏杀菌过程以及其他热加工过程中蛋白质系统的品质变化。
