对于赖丙氨酸的检测方法主要包括氨基酸分析仪法、气相色谱（GC）法、液相色谱（LC）法以及液相色谱-质谱（LC-MS）联用法、脉冲-傅里叶变换核磁共振谱仪法等。目前并未检索到高分辨质谱检测方法。
天津大学精密仪器与光电子工程学院的聂雪梅和中国检验检疫科学研究院食品安全研究所的王菡、张峰*等人经过盐酸水解后直接定量，同时采用的高分辨质谱具有高分辨能力和高灵敏度，能够准确定性定量等优势，无需衍生也能准确测定赖丙氨酸，且测定时间短，对于提高行业检测水平和科学制定牛奶中赖丙氨酸的限量有重要意义。
一、测定条件的优化
1.1 色谱柱的优化
如图1所示，采用C18柱有拖尾现象且无保留，这可能是由于柱长较短，未洗脱干净；使用HILIC及aQ色谱柱分离目标物时，色谱峰响应比Ascentis-C8柱低，影响定量的准确性。Ascentis-C8为中等极性分析柱，Ascentis-C8分析柱可以对较弱极性化合物有较好的保留。根据色谱峰响应、峰性和保留时间，本方法采用Ascentis-C8色谱柱对目标物进行分离。
1.2 流动相的优化
考察甲醇和乙腈2 种有机相对色谱峰形的影响，结果显示，乙腈作为流动相时目标化合物响应更高。乙腈作为有机相对分析物产生更高的响应。选择水相时对比加不同体积分数的甲酸（0%、0.05%、0.1%、0.2%）对色谱峰形的影响。结果显示，在使用0.1%甲酸溶液作为流动相时对赖丙氨酸有良好的色谱分离效果，可兼顾质谱响应，色谱峰峰形较优，流动相中甲酸含量会影响赖丙氨酸的离子化效果，甲酸含量过高会引起竞争性的电离抑制，使得赖丙氨酸在质谱中的响应降低，含量过低会导致离子化效果较差，因此选择0.1%甲酸溶液作为流动相。
1.3 质谱参数的优化
选择全扫描-数据依赖二级扫描模式进行目标物的筛查监测，以母离子和碎片离子精确质量数定性，精确母离子定量，可达到对目标物的筛查及定量目的。在全扫描-数据依赖二级扫描模式下，质谱方法设置一级分辨率70 000，二级分辨率35 000，归一化碰撞能量在25%可得到最佳监测结果，质荷比偏差均小于1.0╳10-6。
1.4 优化后的赖丙氨酸色谱峰
结果显示，经过色谱和质谱条件的优化，选用Ascentis-C8色谱柱（100 mm╳4.6 mm，3 μm）对待测物进行分离，以0.1%甲酸溶液和乙腈作为流动相进行梯度洗脱，在全扫描-数据依赖二级扫描模式下进行检测，色谱峰峰形较好。
二、前处理条件的优化
本实验测定2 种QuECHERS方法乙酸锌净化除脂、乙酸锌+亚铁氰化钾净化除脂和盐酸水解3 种提取方式下赖丙氨酸的含量，发现未经盐酸水解的2 种方法均未检出赖丙氨酸，所以本实验采用盐酸水解的方法。盐酸水解后，净化方式对比了PSA和C18单独净化、两者结合净化以及直接氮吹复溶，发现响应值并无较大区别，因此为节省前处理步骤采用直接氮吹复溶。
三、方法验证
3.1 标准曲线、检出限和定量限结果
配制赖丙氨酸标准溶液（1～200 μg/L），以峰面积（Y）为纵坐标，质量浓度（X，μg/L）为横坐标，绘制标准曲线，在1～200 μg/L质量浓度范围内赖丙氨酸色谱峰面积与质量浓度呈良好线性相关，回归方程为y＝111 362x+17 995.4；相关系数R2为0.999 0。同时样品中赖丙氨酸的检出限和定量限分别为0.01 mg/kg和0.025 mg/kg，表明该方法具有较好的灵敏度，可以对含量较低的分析物进行定量。
3.2 回收率测定结果
选取鲜奶进行回收率实验，在处理样品前加入不同含量标准品，按照前处理方法分别进行样品处理后，在相同条件下进行分析，分2 批次共测定6 次，结果显示，回收率在78.7%～117.1%范围内。
3.3 精密度测定结果
选取某灭菌乳进行重复性实验，按照前处理方法分别进行前处理后，在相同条件下进行分析，分3 批次共测定6 次，结果显示，相对标准偏差为3.64%，此方法的精密度良好。
四、样品分析及评价
4.1 样本中赖丙氨酸定性分析
运用全扫描-数据依赖二级扫描模式收集化合物信息，选取2 个响应值高且有特征性的碎裂片段C5H10N+（m/z 84.081 5）与C6H12NO2+（m/z 130.086 3）以及丰度比进行定性。由图5可得，二级碎片质荷比、分子离子质荷比、母离子的保留时间基本可对复杂牛奶样本中的赖丙氨酸准确定性。
4.2 温度样品含量变化规律的影响
从牧场采集的新鲜牛奶，在6 h内混匀并置于小型模拟牛奶加工设备上，分别加热至50～150 ℃（每隔10 ℃测定1 个样品），加热时间5～10 s，加热处理后置于50 mL样品管中（每个温度点取2 个样），按照赖丙氨酸前处理方式盐酸酸解处理并上机。结果显示，当加热温度升高时，赖丙氨酸含量会随着温度不断变化，从50～110 ℃赖丙氨酸含量随着温度的升高而增加，当加热到120 ℃时含量下降，从120～140 ℃含量波动较小。
4.3 市场样品检测结果
对来自市场不同品牌的12 种液态乳进行测定，根据赖丙氨酸的保留时间及选择的两对子离子峰高的比值进行定性分析，结果显示，超高温瞬时灭菌牛奶的8 个样品的平均含量为5.554 mg/kg，巴氏杀菌牛奶的4 个样品的平均含量为3.745 mg/kg，其含量值在上述赖丙氨酸的变化规律范围内。目前，对于赖丙氨酸在乳制品中的限量，各国均无限量标准。因此，本方法的建立，对于准确获取市场上牛奶中赖丙氨酸的含量情况，制定出符合我国国情的限量标准具有重要参考意义。
结 论
本研究采用高分辨质谱对液态奶中赖丙氨酸进行分析，并进行方法学验证。由于高分辨质谱具有高分辨能力、准确定性、超高灵敏度等优势，又采用了简化前处理的方法，处理时间短，不需要衍生，相对于其他文献中赖丙氨酸的测定方法，具有明显的优势。同时采用小型模拟加工设备对牧场采集的新鲜液态奶进行不同加工条件的处理，并研究赖丙氨酸含量随加热温度的变化规律，在50～110 ℃赖丙氨酸含量随着温度的升高增加，当加热到120 ℃时含量下降，从120～140 ℃含量波动不大。
其后对来自市场不同品牌的12 种液态奶进行测定，其含量符合赖丙氨酸的变化规律范围。通过采用超高效液相色谱-串联质谱可对乳品中的赖丙氨酸实现快速、准确、灵敏检测，对于准确获取市场上乳制品中赖丙氨酸含量情况，制定出符合我国国情的限量标准具有重要参考意义，本方法将在保障乳制品安全中发挥积极作用。
