绿豆是中国主要的食用豆类作物，其生产和出口量居世界首位。作为药食两用的豆科植物，绿豆其本身含有丰富的蛋白质、淀粉、维生素、矿物质及人体必需的氨基酸。但目前对绿豆的开发多为淀粉的加工利用，对绿豆蛋白的开发利用还存在一些局限，造成了资源的严重浪费。因此开发绿豆蛋白，增加绿豆的附加值已成为现代的研究热点。
而绿豆多肽作为绿豆蛋白的酶解物，因其具有低致敏性，且在较低的pH值条件下依然能保持较高溶解性，可减轻肠胃负担的特点所以有着广阔的应用前景，但多数研究只是停留在绿豆蛋白肽本身的生物活性，鲜有绿豆蛋白肽与金属离子结合的报道。锌被称为“生命元素”，在维持人体正常的生理状态和生命活动中起着至关重要的作用。缺锌可导致生长迟缓、免疫性功能障碍和神经性功能障碍等一系列疾病。寻求一种高效、吸收利用率好的补锌制剂迫在眉睫。
为进一步明晰多肽与锌离子螯合的机制以及生物利用率等情况，黑龙江八一农垦大学食品学院的富天昕、张舒和王长远*等人利用绿豆多肽与锌进行螯合，以螯合能力为指标明确螯合工艺的最优条件，采用红外、紫外光谱分析对螯合前后的结构进行比较，推测肽锌螯合位点，并运用扫描电镜和X-射线衍射观察二者表面结构和结晶结构的差异，通过体外肠道模拟实验测定螯合物的生物利用率。本研究可为肽锌螯合的工业化生产及后续的研究提供理论基础。
1、绿豆多肽成分分析
结果显示，绿豆蛋白水解物的蛋白质质量分数在90.31%左右，说明蛋白质含量较高，而且锌离子含量极少，不会对下一步的实验产生影响。综上制备出的绿豆多肽可以用于进一步实验研究。
2、单因素试验结果
2.1 反应pH值对螯合能力的影响
结果显示，肽锌螯合反应开始，随着反应pH值的不断增大，肽锌螯合能力逐渐增强，在pH值为6时，其螯合能力达到最大，随后缓慢下降。造成这种情况的原因是，当螯合反应体系中反应pH值太低时，H+则会与锌离子争夺供电子基团，不利于螯合物的生成。当反应pH值过高时，锌离子则会与OH-生成Zn(OH)2沉淀，不利于螯合反应的进行。
2.2 反应温度对螯合能力的影响
结果显示，螯合能力随着反应温度的上升出现先升高后下降的趋势，在反应温度达到50 ℃时，其螯合能力达到最大，但在超过60 ℃时，肽锌螯合能力则急速降低。出现这种趋势的原因是开始时温度升高会使溶液中的锌离子加速溶出，增大了锌离子与肽的碰撞频率，有利于螯合反应的进行。但由于肽锌螯合的过程属于放热过程，且高温易破坏多肽的结构，减少了多肽锌的结合位点，不利于螯合反应的进行。
2.3 肽锌质量比对螯合能力的影响
结果显示，在螯合反应开始时，螯合能力随着多肽比例的增加而不断增大，当其质量比达到6∶1时，肽锌螯合能力达到最高值，随后随着肽锌质量比的增大其螯合能力开始降低。
2.4 反应时间对螯合能力的影响
从图4可以看出，肽锌螯合反应时间逐渐延长，肽锌螯合能力不断增大，当反应时间达到80 min左右时，肽锌螯合能力达到最大，之后随着反应时间的延长，其螯合能力略有降低。故选取60～100 min作为后续研究。
3、绿豆多肽成分分析
3.1 响应试验设计及结果
为获得螯合能力最高的绿豆多肽锌螯合物，采用响应面设计对螯合条件（肽锌质量比、反应温度、反应时间、pH值）进行优化，以期获得螯合能力最高的螯合物。以X1、X2、X3、X4分别表示反应体系的pH值、反应温度、肽锌质量比、反应时间以及螯合能力（Y）为响应值，设计4因素3水平的二次回归方程拟合因素和响应值间的函数关系。根据试验结果建立多元二次回归方程，结果显示，此响应面的模型显着，失拟项不显着，且R2Adj为0.974 5，表示回归方程模型具有良好的实际试验拟合度，误差很小，可以在实际实验肽锌螯合能力的研究和分析中使用。
3.2 响应面分析
从图5可以看出，曲面形状均近似椭圆形，说明交互作用较显着。如图5A所示，反应pH值和反应温度沿着弯曲表面上升的斜率陡峭，并且轴向轮廓致密，故反应pH值和反应温度存在显着的交互作用，且明显可以看出反应pH值对肽锌螯合能力的影响相比温度较大。从图5B可以看出，当反应pH值一定时，随着肽锌质量比的不断增大，肽锌螯合能力呈现先增强后逐渐减弱的趋势，当肽锌质量比一定时，反应pH值不断升高，肽锌螯合能力也呈现先增强后逐渐减弱的趋势。由图5C可知，反应温度和反应时间沿曲面上升的坡面较缓且轴向等高线密集程度较小，故反应温度和反应时间存在显着的交互作用，反应温度与反应时间的交互作用对肽锌螯合能力的影响也是呈现先增强后减弱的趋势。结合Design Expert试验设计软件分析得到佳螯合条件为肽锌质量比为6.19∶1、反应温度49.9 ℃、反应pH 6.3、反应时间82.7 min，此时得到的响应预测值即52.50 mg/g。
3.3 验证实验
为后续的生产加工，将实际的应用调整为肽锌质量比6.20∶1、反应温度50 ℃、反应pH 6.3、反应时间83 min，实际得到的肽锌螯合能力的平均值为52.19 mg/g，与预测值相差0.59%，与响应面预测值较为吻合。故而，本实验所采用响应面法所得的绿豆多肽锌制备的优化工艺具有可靠性。
4、绿豆多肽成分分析
4.1 紫外光谱分析
结果显示，肽与螯合物的紫外吸收光谱发生了明显的改变，说明锌离子与肽发生了相互作用，并且产生了一种不同于肽的新的化合物。可以看出，肽在209 nm波长处有最大吸收峰，这是肽键上的C＝O电子跃迁的结果，而螯合后的吸收峰移至205 nm波长处，是因为锌离子与N、O发生配位结合，使肽键上的C＝O电子跃迁受到了影响。此外，肽在276 nm波长处有较弱的吸收峰，螯合后移至273 nm波长处且强度明显增加，这是配体N—C—O电子发生跃迁的结果。螯合前后紫外光谱的变化说明了螯合物的生成。
4.2 FTIR分析
由图7可以看出，螯合前后的红外光谱图发生了显着的变化，说明螯合反应的发生，并生成了新的物质，从而使氨基酸的振动频率发生改变，引起吸收峰的变化。绿豆多肽在3 385 cm-1处出现—NH和—OH伸缩振动频率重叠的宽吸收峰，而在螯合物的红外光谱中其波数增加至3 404 cm-1，且强度减弱，说明锌离子与—NH和—OH基团发生反应，导致电子云密度增大。绿豆多肽酰胺I带的波数为1 634、1 446 cm-1，在与锌离子发生螯合反应后，波数减少到1 585、1 413 cm-1，这代表了由羰基化合物引起的红外吸收，发生了羧酸根生物反对称伸缩振动和对称伸缩振动。
此外，绿豆多肽在1 037 cm-1处的吸收峰，在与锌离子螯合后移至1 058 cm-1处，且强度增大。说明锌离子与NH2发生了结合。绿豆多肽红外光谱中—NH—C＝O上—NH的吸收峰在1 109 cm-1，与锌离子发生反应后消失不见，说明锌离子发生螯合的位置应该是—NH—C＝O上—NH基团。综上所述，与锌离子发生螯合的位置可能是—NH—C＝O上的—NH，—COOH上的—OH和末端—NH2，这与紫外光谱显示的结果一致。
4.3 扫描电镜分析
利用扫描电镜对肽粉末和肽锌螯合物粉末的微观表面结构进行观察，将其在电镜下放大500 倍。由图8A可以看出，肽表面呈多孔状结构，且较为疏松。从图8B可以看出，肽锌螯合物表面呈片状结构，且多为聚合状态。这是因为多肽与锌离子通过离子键、配位键结合从而生成了小颗粒聚集体。扫描电镜从物质微观表面结构再次证明了螯合物的形成。
4.4 X-射线衍射分析
由图9可看出，绿豆多肽与螯合物的的衍射图谱有很大差别。ZnSO4·7H2O具有明显的结晶衍射峰，而螯合物则没有明显的结晶衍射峰，如果绿豆多肽与锌离子仅仅是物理的混合，相互作用较弱，则螯合物会显示出结晶区。由此可以推测，锌离子在与绿豆多肽发生螯合反应时，晶体结构发生了变化，使结晶度显着下降。结晶结构发生变化的原因是绿豆多肽的末端氨基、羧基与锌离子发生了配位结合，从而导致了晶体结构发生改变。这与上述所测结构的结果一致。
5、绿豆多肽成分分析
结果显示，肽锌螯合物和ZnSO4·7H2O经胃消化后的溶解率分别98.85%、97.78%，二者差异显着（P＜0.05）；经肠道消化后的溶解率分别为54.61%、40.76%，二者差异极显着（P＜0.01）；透析率分别为44.24%、30.15%，差异极显着（P＜0.01）。说明螯合物的溶解率在胃肠中均有良好的溶解性，且都高于无机锌盐。透析率较无机盐高的原因是锌离子与小肽结合后以分子形式直接通过透析袋，而无机锌离子较多会生成沉淀，导致无法透过。体外消化实验表明肽锌螯合物相较于无机锌盐有较好的生物利用率。
结 论
本研究将水解后的绿豆多肽与锌离子进行螯合，以螯合能力为指标，考察反应温度、反应pH值、肽锌质量比、反应时间对螯合能力的影响。通过响应面结合实际应用得出最佳工艺条件为肽锌质量比6.20∶1、反应温度50 ℃、反应pH 6.3、反应时间83 min，实际得到的肽锌螯合能力为52.19 mg/g；对螯合绿豆多肽和肽锌螯合物的结构进行紫外光谱、FTIR、扫描电镜和X-射线衍射分析，结果表明锌离子与绿豆多肽的末端氨基、羧基以及酰胺键上的氮氢基团发生了配位反应，螯合后形成的新物质从微观表面及微观结构均有较大变化，说明螯合物与绿豆多肽分属不同物质；对螯合生成的新物质进行体外消化模拟实验，实验证明，肽锌螯合物在胃肠中的溶解率和透析率都优于无机锌盐，肽锌螯合物具有较好的生物利用率。本实验可为肽锌螯合物的生产以及后续的研究提供理论支持。
