利用HPLC-MS/MS鉴定出50 种酚类，其中分心木中有41 种酚类，内种皮中32 种，核桃花中29 种；
核桃不同组织部位对核桃酚类种类和含量的影响大于提取方法的影响；
核桃内种皮中总酚、类黄酮和单宁的种类和含量高于分心木和花；
核桃内种皮中抗氧化能力最高。
摘要
采用甲醇冷凝回流提取、超声波提取和酶解辅助三种方法，提取了核桃分心木、内种皮和花的总酚类物质，比较了不同提取物的酚类种类、含量及抗氧化能力的差异。结果表明，利用HPLC-MS/MS鉴定出50 种酚类，其中分心木中有41 种酚类，内种皮中32 种，核桃花中29 种。核桃内种皮中的单宁含量高于分心木和花中的含量。主成分分析说明70％以上的变化是由于酚类成分之间的差异造成的。核桃中的酚类物质均具有显着的抗氧化活性，内种皮中抗氧化能力最高。该研究对核桃中的酚类化合物进行了分析和比较，可以进一步为开发功能性核桃方便食品提供基础。
关键词
分心木；核桃内种皮；核桃花；酚类化合物；抗氧化活性
Introduction
核桃被认为是世界上最重要的坚果之一，由于其具有高度营养的价值使它代表了地中海饮食的重要组成部分。根据最近的报道，核桃似乎在健康方面具有举足轻重的地位，这主要归功于丰富的生物活性化合物，例如植物固醇，膳食纤维和多酚。这些生物活性物质使核桃具有多种功能，包括抗氧化、抗菌抗病毒、抗癌、抗炎、改善认知功能和减轻免疫毒性等。
在中国发现的一种品种，云南核桃分为许多部分[分心木（DJF），核桃内种皮（WP）和核桃花（FJR）]，每个部分都有许多具有促进健康作用的物质。分心木是核桃之间的木质间隙，通常在食品加工过程中丢弃。分心木的生物活性物质分为黄酮、多酚、单宁、不饱和脂肪酸等。至于核桃仁，核桃仁的外部有一层薄膜，是核桃内种皮。核桃内种皮含有丰富的多酚类物质，主要是酚酸、可水解的单宁和少量的黄酮。先前的研究报道，单宁酸可以被水解和浓缩，也是核桃中含量最高的物质。核桃内种皮是核桃中酚类化合物的主要来源，尽管它仅占总质量的极低百分比。核桃花被认为是穗状形态，在中国一直被用作传统食品和中药。但是，有关核桃花的化学成分的报道有限，这阻碍了其营养价值和药用价值的进一步探究。
保留有价值成分的结构和生物学特性很大程度上取决于所用提取方法的类型。因此，必须采用适当的萃取方法。甲醇冷凝回流萃取是基于甲醇和水的扩散和渗透作用来溶解酚类物质的传统方法之一。回流的目的是防止惰性原料在较高温度下逸出。因此，该方法能够提高提取效率。实际上，物理和化学辅助方法可以提高多酚的收率，例如超声辅助提取和酶辅助提取。这些提取方法通过超声波的强烈振动和纤维素酶的作用，破坏细胞壁并使细胞内的多酚暴露出来。直到最近，以前的研究已经对核桃中的酚类成分进行了定性和定量分析。但是，除了不同的提取方法（甲醇冷凝回流提取、超声辅助提取和酶辅助提取）对成分和含量的影响外，很少有研究专注于比较分心木，核桃内种皮和核桃花中酚类成分的差异。
在本研究中，合肥工业大学食品与生物工程学院的Yi-Ge Zhang、Sheng-Xiong Chen和西南林业大学西南地区林业资源保护与利用重点实验室的Huan Kan等人分析并比较了用不同提取方法提取的核桃中分心木、核桃内种皮和核桃花中的酚类成分。此外，还评估了这些所得酚类的抗氧化能力，可以进一步为开发功能性核桃方便食品提供基础。
Results and discussion
三种方法制备的核桃内种皮提取物中单宁的含量从573.19至699.78 mg Cat E/g，明显高于核桃的其他部分。酶解制备核桃内种皮的总酚含量显着高于分心木和核桃花中的。
利用LC-MS/MS方法，总共鉴定了50 种酚类化合物。所有鉴定出的酚类物质的保留时间均在25 min内，大多数在15 min的初始时间内浓缩。保留时间最早的峰对应于奎宁酸，最后的峰为白杨素，保留时间为24.04 min。所鉴定的活性物质中，包括酚酸、黄酮、单宁和醌等成分。共鉴定出11 种酚酸，分别为鞣花酸、奎尼酸、香豆酰奎尼酸、壬二酸、对香豆酸、羟基扁桃酸、阿魏酸异构体、原儿茶酸、咖啡酸和两种羟基苯甲酸对羟基苯甲酸和丁香酸。共鉴定出20 种黄酮类化合物。一般来说，可以基于葡萄糖和鞣花酸基团的中性丢失来鉴定单宁，我们鉴定出12 种单宁，包括（+）-儿茶素、单没食子酰基葡萄糖、甲基没食子酰基己糖苷、HHDP-葡萄糖异构体、二没食子酰基-葡萄糖、表没食子儿茶素、没食子酰基-HHDP -葡萄糖、三没食子酰基-葡萄糖、双-HHDP-葡萄糖、四没食子酰基-葡萄糖、没食子酰基-双-HHDP-葡萄糖和三没食子基-HHDP-葡萄糖。我们的结果中，鉴定出3 个醌，分别为萘二醇异构体、二羟基萘醌异构体和4,9-二羟基萘[2,3-c]呋喃-5,8-二酮异构体。
分心木中鉴定出41 种酚类化合物，23 种在三种萃取方法中相同。使用不同方法提取的核桃分心木中酚类成分的种类略有差异，酶解法（EE）、超声辅助法（UE）和甲醇冷凝回流法（ME）分别获得了30、31和33 种成分。在核桃内种皮中，总共鉴定出32 种酚类物质，酶解法（EE）、超声辅助法（UE）和甲醇冷凝回流法（ME）分别鉴定出了28、26和26 种，其中21 种酚类在三种提取方法提取物中均存在。核桃花中总共鉴定出29 种酚类物质，其中21 种酚类在三种提取方法提取物中均存在。
分心木、核桃内种皮和核桃花在生物活性物质的成分和含量上有很大差异。核桃花是核桃树的花朵，其成分与茎和叶的成分相似；核桃内种皮是核桃仁外部的薄膜，因此其组成与核桃仁相似，并且含有大量脂质。此外，分心木是一种独立于核桃仁的木质屏障，其成分与核桃仁大不相同。此外，营养价值不能简单地用高低来衡量，因为不同的食物可以满足不同的营养要求 因此，即使核桃的成分和含量不同，核桃及其副产品也是具有人类保健功能的天然营养保健食品。
主成分分析（PCA）显示，3 种提取方法之间对酚类聚集性的影响是远小于核桃不同部分（如分心木、核桃内种皮和核桃花）的影响。通过分析显示72％酚数据集的总变异性，与核桃分心木、核桃内种皮和核桃花的差异相比，核桃的提取方法的差异影响较小。核桃的不同部分之间酚类的差异是不同酚聚集的主要原因。
分心木、核桃内种皮和核桃花在酚的组成和含量上存在显着差异。在分心木、核桃内种皮和核桃花的常见成分中，我们选择了5 种含量较高的鞣花酸、鞣花酸戊糖苷异构体、7-羟基-甲基香豆素、对羟基苯甲酸、阿魏酸异构体进行比较。从提取酚类物质的浓度角度看，内种皮中鞣花酸的含量最高，但就提取物的总比例而言，核桃花中鞣花酸在总提取物中的比例高于内种皮和分心木，且鞣花酸戊糖苷异构体仅占内种皮的很大比例。分心木中7-羟基-甲基香豆素含量是继鞣花酸之后的第二高酚，含量高且浓度范围为240.45至332.18 μg/g。对羟基苯甲酸虽然含量不高，但通过三种萃取方法在分心木，核桃内种皮和核桃花中检测到了具有雌激素活性的对羟基苯甲酸。另一种在核桃不同提取液中占比相差不大的阿魏酸异构体也是一种具有健康促进功能的酚酸。
通过四种测定法（DPPH˙，ABTS˙+，˙OH和Fe2+）对核桃分心木、内种皮和花提取物的抗氧化能力进行了评估。核桃内种皮的抗氧化活性强于核桃花和分心木，其趋势类似于核桃不同部位之间酚类化合物含量的差异。核桃内种皮中的ABTS˙+分析显示出最强的抗氧化性，而分心木中的DPPH˙测定显示出最低的抗氧化性。在核桃内种皮和核桃花中，提取方法通过以下方式影响抗氧化能力：酶解法> 超声辅助法> 冷凝回流法。然而，在分心木中，抗氧化能力大小为冷凝回流法> 酶解法> 超声辅助法，这也与冷凝回流法更适合于分心木中物质的提取有关。
Conclusion
本研究利用LC-MS/MS从核桃分心木、内种皮和花中鉴定出总共50 种酚类物质，分别包括酚酸、黄酮、丹宁酸和一些香豆素衍生物。核桃各部位的酚类物质表现出显着差异：分心木中鉴定出41 种物质，内种皮中鉴定出32 种物质，花中鉴定出29 种物质。鞣花酸被认为是核桃中含量最高的酚。尽管核桃内种皮在提取的部分中酚的种类较少，但酚的含量是最高的，高达2674.37-3053.43 mg GAE/g。三种提取方法中，酶解法是最适合提取大量酚类化合物的方法。主成分分析解释了超过70％的差异是由于酚类成分之间的比较。核桃内种皮提取物显示出最高的抗氧化能力，这可能是与其最高的酚含量相关。
