海南大学食品学院的马 婷、夏光华、李 川、申铉日*选用罗非鱼头磷脂（TH-PL），探讨其对单核巨噬细胞RAW264.7分化成破骨细胞的影响，为TH-PL作为一种治疗骨基质代谢疾病的新型功能性食品的应用提供科学依据，也为提高罗非鱼的附加值并缓解环境污染问题提供新途径。
1、TH-PL的硅胶柱层析分离和薄层色谱检识
Dittmer-Lester显色剂专一地对全部磷脂显色，颜色为蓝色，而对中性脂、糖脂等化合物不显色，Fr III在Dittmer-Lester试剂显色下呈蓝色斑点（Rf＝0.84），而Fr I和Fr II没有呈色反应。因此，Fr III可初步鉴定为TH-PL。
2、傅里叶红外变换光谱（FTIR）分析结果
波数3 424.91 cm－1的强吸收为—OH的伸缩振动；波数3 010.54 cm－1与2 853.17 cm－1的吸收峰同时出现，表明TH-PL中既含有饱和CH，又含有不饱和的CH；波数2 922.90 cm－1和1 463.73 cm－1分别为—CH2—和—CH3的特征吸收峰；波数1 739.20 cm－1为饱和脂肪酸中C＝O的伸缩振动特征吸收峰；波数1 648 cm－1为苯环的特征吸收峰；波数1 169.04 cm－1为—C＝O—O—的特征吸收峰（sn-1）；波数1 238.85 cm－1的强吸收峰为PO2—的伸缩振动；波数1 061.70 cm－1为C—O—PO2—的伸缩振动；波数969.53 cm－1为C—C—N＋的特征吸收峰；波数720.59 cm－1为4 个—CH2—所组成的长链的吸收峰。
3、脂肪酸分析结果
TH-PL中饱和脂肪酸（SFA）约占总脂肪酸含量的34.84%，其中以C16:0（棕榈酸）为主，其次为C18:0（硬脂酸）和C14:0（豆蔻酸），与文献报道的在一些淡水鱼和海洋生物的磷脂中存在大量的棕榈酸相符。单不饱和脂肪酸（MUFA）约占22.05%，其中以C18:1（油酸）为主，此外还含有一定量的C16:1（棕榈油酸）。TH-PL中多不饱和脂肪酸（PUFA）约占总脂肪酸的38%，其中C18:2 n-6（亚油酸）含量最高，其次为C22:6 n-3（DHA）和C18:3 n-3（亚麻酸）等。
4、TH-PL对RAW264.7细胞活性的影响
与空白对照组相比，TH-PL作用RAW264.7细胞2 d时，对RAW264.7细胞几乎无毒副作用，反而在高质量浓度下具有促进细胞增殖的作用。因此，可以排除TH-PL自身毒性对抑制破骨细胞活性实验所产生的假阳性作用，表明0～100 μg/mL范围内的TH-PL可用于后续的细胞实验中。
5、TH-PL对RAW264.7细胞向破骨细胞分化的影响
正常组RAW 264.7培养5 d后进行TRAP染色，可见大小相对均一的单核巨噬细胞，而经50 ng/mL的RANKL诱导RAW 264.7细胞5 d后可见大量TRAP阳性的多核细胞（核不少于3 个），细胞体积明显增大，表示在此条件下破骨细胞模型建立成功。与模型组相比，随着TH-PL质量浓度的升高，破骨细胞数量相应减少，细胞核的数量和细胞的平均直径也明显降低，呈现出一定的剂量依赖性。其中，100 μg/mL TH-PL具有显着抑制RAW264.7细胞向破骨细胞分化的作用，达到了与DHA阳性对照组相似的效果。
6、TH-PL对破骨细胞凋亡的影响
质量浓度为50、100 μg/mL的TH-PL和DHA均可显着促进破骨细胞的凋亡，总凋亡率分别为12.07%、24.17%、22.07%，且主要为早期凋亡（Q1）。前人研究发现，磷脂酰胆碱通过诱导肝癌细胞Hep-G2的凋亡（凋亡率为3.11%），进而抑制癌细胞的生长。
7、TH-PL对破骨细胞线粒体膜电位及caspase-3蛋白表达量的影响
不同质量浓度（25、50、100 μg/mL）TH-PL干预破骨细胞后，细胞荧光强度逐渐下降，且呈剂量依赖性。当TH-PL的质量浓度为100 μg/mL时细胞线粒体膜电位下降到76.10%（与模型组相比）。为进一步探讨TH-PL对破骨细胞线粒体凋亡传导通路的影响，实验采用Western blotting方法检测TH-PL处理后破骨细胞中caspase-3表达量的变化情况。与模型组相比，用50、100 μg/mL TH-PL干预细胞后，显着地提高了caspase-3的表达量。
结 论
综上所述，本研究制备的TH-PL在一定质量浓度下具有显着抑制破骨前体细胞分化和促进破骨细胞凋亡的作用，有望成为抑制骨质疏松作用的功能性食品原料。
