目前，黄水菌群的研究方法有传统的纯化培养方法、非培养的聚合酶链式反应-变性梯度凝胶电泳（PCR-DGGE）方法和磷脂分析法。此外，醋酸杆菌属（Acetobacter）、蛋白杆菌属（Proteiniphilum）、喜热菌属（Caloramator）和甲烷菌也在黄水中检测到。基于自然界中未知菌/未培养菌占多数的情况，需要相对更准确的免培养方法全面解析黄水中的菌群组成。黄水菌群中的厌氧菌有可能对窖泥菌群的老熟起重要作用。
因此，有必要全面了解新老窖池新鲜黄水中的菌群组成差异及封闭静置培养对黄水菌群，尤其是对厌氧菌群的影响。窖池发酵25 a，窖泥基本达到老熟。安徽省固态发酵工程技术研究中心的张会敏、孟雅静和清华大学化工系的邢新会*等人从安徽省某着名浓香型白酒公司的新窖池（6 a窖龄）和老窖池（50 a以上窖龄）中取新鲜黄水，分别对新鲜黄水和封闭静置5 个月的黄水分析其原核微生物组成和理化性质。鉴于未知菌/未培养菌占自然界大多数 的现状[12]，本研究采用高通量测序方式全面解读新老窖池黄水原核微生物组成差异，以及封闭静置培养（厌氧环境）对黄水中的菌群组成的影响。
1 黄水样本的理化性质
新老窖池的新鲜黄水相比较，两者的淀粉、还原糖、丙酸、乳酸、乙醇含量不具有显着性差异，说明新老窖池发酵粮食（淀粉）产生乙醇的主体过程无差异。结果显示，与新窖池的新鲜黄水相比，老窖池的新鲜黄水中，丁酸、己酸、戊酸、乙酸、铵态氮的值偏高，而酸度略低。说明：1）与新窖池相比，老窖池发酵过程中代谢形成的各种酸等风味物质较丰富；2）老窖池发酵过程中，铵态氮含量比较高；3）老窖池的新鲜黄水酸度略低。
新老窖池黄水经过5 个月的封闭静置培养后，丙酸、乳酸值无显着变化，淀粉、还原糖、酸度值不同程度地降低，而铵态氮有所增加。说明静置培养过程黄水中的菌群生长消耗了其中的淀粉、还原糖，同时生成了铵态氮（降解氨基酸的菌）。最终黄水酸度有所下降。新老窖池黄水培养后的不同之处在于：老窖池黄水经培养后，己酸和戊酸的值显着降低；新窖池黄水培养后乙醇含量显着降低，丁酸和乙酸的值显着增加。新窖池黄水经过封闭静置培养后，乙醇减少，同时丁酸和乙酸增加。相比较而言，老窖池黄水中的丁酸/己酸菌在封闭静置培养期间似乎并不活跃。
2 黄水原核微生物群落的α多样性
通过Illumina MiSeq高通量测序，得到673 738 条平均长度为207 bp的优质序列，平均30 182～53 152 条/样本。对所有样本10 次抽平（subsample）取平均四舍五入后，得到序列26 931～26 981 条/样本，进行后续分析。OTU聚类（97%相似度）得到4 886 个OTU，平均77～580 个/样本。每个样本的测序覆盖率大于99%，说明测序数目足够，测序序列可以代表其菌群组成。得到注释（门、纲、目、科、属）的序列大于99.9%，无法得到注释的序列仅12 条序列，说明对窖泥中大量的未培养菌也充分实现了系统分类。
结果显示，新老窖池的新鲜黄水相比较，两者微生物群落的OTU数目、Shannon指数和Chao 1指数都不具有显着性差异，经过封闭静置培养5 个月后，3 个微生物群落参数值均显着升高，说明静置培养后黄水中的菌群丰度和多样性增加。
3 黄水原核微生物群落的β多样性
对OTU注释，总共得到35 个门，其中32 个细菌门，3 个古菌门。在门的水平上，在新老窖池新鲜黄水中，厚壁菌门（Firmicutes）为绝对优势菌门，分别占新老窖池新鲜黄水样本的98.46%和95.72%。将相对丰度超过0.1%的门定义为优势菌门（图1）。除Firmicutes外，其余4 个优势菌门在新老窖池新鲜黄水中的相对丰度依次为：变形菌门（Proteobacteria，1.0%和2.0%）、放线菌（Actinobacteria，0.11%和1.0%）、拟杆菌门（Bacteroidetes，0.1%和0.36%）和绿弯菌门（Chloroflexi，0.03%和0.45%）。Firmicutes在黄水中的绝对优势情况也存在于窖泥中，但在黄水中占的比例更大。
经过封闭静置培养5 个月后，新老窖池的黄水中的菌群组成发生变化。新老窖池黄水中Firmicutes的相对丰度分别下降为63.14%和79.59%；Proteobacteria在两者中的丰度分别大幅上升至20.86%和12.88%；Bacteroidetes则分别上升至6.21%和1.74%；Actinobacteria分别上升至0.63%和2.79%；Chloroflexi分别上升至1.32%和0.47%。此外，经过静置培养后，互养菌门（Synergistetes）在老窖池黄水中的相对丰度上升幅度很大（由0.06%变为2.11%），而在新窖池黄水中变化幅度相对较小（由0.02%变为0.46%）。通过静置培养，黄水菌群与窖泥菌群中的组成更接近了，比如Firmicutes与窖泥中的菌群组成更接近。
对O T U 注释，共得到6 6 4 个属，注释度为97.81%，其余序列只能不同程度地注释到门、纲、目、科等级别。注释度之所以如此高，因为黄水样本中的属种非常集中，Lactobacillus占绝对优势。除Lactobacillus，黄水样本中相对丰度超过1%的优势菌属还有：不动杆菌属（Acinetobacter）、双歧黄色高温菌属（Thermoflavimicrobium）、芽孢杆菌属（Bacillus）、苍白杆菌属（Ochrobactrum）、寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）、产己酸菌属（Caproiciproducens）和Aminobacterium（图2）。
对18 个黄水样本菌群组成进行Weighted Unifrac Distance聚类发现，所有黄水样本分为两大组：新鲜黄水样本组和封闭静置培养后的黄水样本组。而2 个组的组内样本，老窖池黄水与新窖池黄水差异很不明显，样本交叉存在。由此可知，与窖池的窖龄相比，是否静置培养对黄水样本的菌群组成影响更大。
深入分析黄水中优势菌属在封闭静置培养前后的变化可知，经过封闭静置培养后，新老窖池黄水样本中的绝对优势菌属Lactobacillus的相对丰度分别降低至52.5%和68.55%。推测很可能与封闭静置培养条件下的缺氧环境不利于兼性厌氧菌Lactobacillus的增殖有一定关系。此外，黄水中的其余7 个优势菌属的相对丰度都显着性增加。
黄水中的Acinetobacter来自于池壁泥。Thermoflavimicrobium、Ochrobactrum和Stenotrophomonas均为好氧菌，土壤中常见菌，鉴于池底泥的厌氧环境，其有可能也来自于池壁泥中的土壤。Bacillus在自然界广泛存在，在窖泥和酿酒大曲中都有。Caproiciproducens在窖泥中大量存在，对产生浓香型白酒中的风味成分己酸的产生具有重要作用。Aminobacterium在老窖泥中的相对丰度更大，具有降解氨基酸的功能。分析在黄水封闭静置培养前期，环境中有一定的氧气存在，促进了好氧菌的生长繁殖。随着封闭环境中的氧气耗尽，也促进了来自窖泥的厌氧菌，如Caproiciproducens和Aminobacterium的生长繁殖。其中Aminobacterium在老窖泥中的含量远高于新窖泥，而在经过静置培养的黄水中，其在老窖池黄水中的菌群相对丰度大于新窖池。
除上述提到的Caproiciproducens和Aminobacterium，窖泥中还存在很多功能菌， 如棒状杆菌（Caldicoprobacter）、贪铜菌属（Cupriavidus）、甲烷囊菌属（Methanoculleus）、瘤梭菌（Ruminiclostridium）、Sedimentibacter和互营单胞菌属（Syntrophomonas），其对窖泥的老熟具有很重要的作用。菌属在4 组黄水中的相对丰度结果显示，经过封闭静置培养后，6 株菌在新老窖池黄水中的相对丰度都有不同程度的升高。与新窖池黄水相比，老窖池黄水经过封闭静置培养Methanoculleus、Sedimentibacter、Syntrophomonas的相对丰度增加更多。说明黄水中含有大量促进窖泥老熟的菌种，且黄水可以提供这些菌种在厌氧条件下生长所需要的营养物质。
4 黄水样本理化性质与菌群之间的RDA
如图6所示，2 个主成分的总解释度为87.49%，但是两个坐标轴上的解释度相差悬殊，主要集中在RDA1（86.16%）。以横轴为分界点，封闭静置培养前的新鲜黄水样本集中在左侧，静置培养后的黄水样本散布在右侧。由此也可得知，与窖池的窖龄相比，是否静置培养对黄水样本的菌群组成影响更大。图6中还原糖、淀粉、酸度和乙醇与新鲜黄水样本菌群呈强烈正相关，铵态氮与静置培养黄水呈正相关，表明新鲜黄水中还原糖、淀粉、酸度和乙醇的值偏高，静置培养后的黄水铵态氮升高。使用互动向前选择程序验收11 个理化因子，发现参数还原糖的解释度最高65%（P＜0.01）。此外，其余理化指标的贡献率都不具有显着性，指标（解释度）分别为：己酸（6.2%）、乳酸（5.9%）、铵态氮（2.7%）、乙酸（2.2%）、丁酸（1.7%）、酸度（1.4%）、淀粉（1.2%）、乙醇（0.9%）、戊酸（0.3%）、丙酸（0.2%）。
讨 论
新老窖池新鲜黄水中淀粉、还原糖、丙酸、乳酸、乙醇的含量不具有显着性差异。与新窖池相比，老窖池新鲜黄水中，即老窖池酒醅发酵过程中产生的丁酸、己酸、戊酸、乙酸等风味物质含量较丰富，同时产生的铵态氮的含量较高。己酸是生成浓香型白酒特色风味物质己酸乙酯的前体物质，与“窖池越老，酒质越好”的结论一致。铵态氮是菌群生长的氮源，老窖池黄水中铵态氮含量高与老窖池中菌群含量更丰富有关系。
新老窖池的黄水样本，经过5 个月的封闭静置培养，黄水中的淀粉、还原糖被消耗，同时酸度也略有下降，而铵态氮略有增加。该过程展示了窖泥老熟过程中其理化性质的变化。从一定程度上来说，窖泥的老熟过程其实是黄水浸入窖泥（窖池池壁和池底土壤）后，静置生长的同时促使窖泥理化性质和菌群结构变化的过程。将来有必要寻找适宜的黄水培养条件，加强乳酸降解菌株的降解作用，提高黄水pH值，促进黄水菌群的老熟。
在新老窖池的新鲜黄水样本中，其菌群组成的差异不大，其中相对丰度超过95%的绝对优势菌种是Lactobacillus。经过5 个月的封闭静置培养，新老窖池黄水中的菌群组成发生变化，其中Lactobacillus的相对丰度显着降低，而其余一些好氧菌和厌氧菌的相对丰度提高，其中包括一些老熟窖泥中相对丰度很高的菌属。这种黄水菌群的变化过程是窖泥菌群老熟过程中其菌群结构变化的表现。在窖泥老熟过程中，周期性来自于黄水的菌群，受各种理化性质和厌氧情况的影响，菌群结构逐渐趋于稳定，即窖泥的老熟状态。与窖泥相类似，新老窖池黄水的理化性质与其菌群组成是相互影响的。黄水理化因子与菌群之间的RDA结果表明，与窖龄比较，封闭静置培养对黄水菌群的影响更大。理化因子中还原糖对菌群解释度最高，达65%，说明菌群生长前期，对还原糖的需求度最高。
本研究通过高通量测序分析黄水中的原核菌群组成，证明静置培养有利于窖泥老熟菌属的增加，尤其是老黄水中，窖泥老熟菌属的增加更明显。Methanoculleus相对丰度从接近于0%上升到0.24%。静置培养后的老黄水中Methanoculleus的相对丰度尽管没有达到老窖泥中的丰度，但说明黄水中天然有促进窖泥老熟的菌种存在，为将来通过自然培养黄水改良窖泥提供了一种思路。而考虑到黄水环境与窖泥环境的差异，需要进一步摸索适宜黄水中窖泥老熟菌种生存繁殖的条件。实现对黄水的自然培养并应用于促进窖泥老熟的养护，不但有利于促进窖泥老熟，对黄水的处理也有重要意义。因为黄水的化学需氧量值很高，排放会远超过国家允许的废水排放指标。本研究尝试了直接静置厌氧培养黄水的方法，可能解决黄水的处理问题，将黄水变废为宝，用于窖泥改良，将来还需要对黄水作为“液体窖泥”的培养条件进行进一步研究。
