我国传统大豆发酵食品历史悠久，但对大豆发酵食品的发酵菌株和功能菌株的研究还较少。昆明理工大学生命科学与技术学院的刘彦敏、沈璐和伊日布斯*等人以蛋白酶、纳豆激酶、产γ-PGA性能和生物素依赖特性为筛选指标，从传统大豆发酵食品和稻草中分离获得8 株具有典型纳豆芽孢杆菌特性的枯草芽孢杆菌菌株，进行形态学和系统发育分析，进一步通过纳豆发酵实验获得具有纳豆激酶活性、感官效果良好的本地化纳豆食品，以期获得有良好的商业化前景。
1 纳豆芽孢杆菌的筛选
本研究分别从河南豆酱、腾冲豆豉和玉溪稻草样品中初筛分离得到了96、162 株和68 株产芽孢的菌株；经蛋白酶活性复筛分别获得84、154 株和64 株产蛋白酶性能优良的菌株；进一步γ-PGA筛选得到56、33 株和33 株产γ-PGA的菌株，其中拉丝程度和γ-PGA产量在评分3 分以上的优良菌株分别有26、31 株和28 株；生物素依赖筛选分别获得5、2 株和1 株生物素缺陷型菌株；所获的生物素缺陷型菌株在纤维蛋白琼脂培养基上都表现出了产纳豆激酶的能力。
从河南豆酱、腾冲豆豉和玉溪稻草样品中的326 株产芽孢的菌株中筛选到产蛋白酶和γ-PGA能力优良、生物素缺陷和产纳豆激酶的菌株共8 株，其中河南豆酱中分离得到5 株具有纳豆特性的菌株，命名为HN72、HN10、HN48、HN35、HN67；腾冲豆豉中分离得到2 株具有纳豆特性的菌株，命名为TC100、TC103；玉溪稻草样品中分离得到1 株具有纳豆芽孢杆菌特性的菌株，命名为DC21，得到所获菌株的筛选指标结果。
2 分离菌株的鉴定
2.1 分离菌株的形态学特征
如图1所示，菌落表面呈乳白色或微黄色，湿润，不透明，扁平有褶皱，菌落形态呈近圆形。革兰氏阳性，细胞呈短杆状，单个或链状排列。在高温、低温、干燥、光线和化学药物存的等不稳定的条件下产生芽孢。具有枯草芽孢杆菌的形态学特征。
2.2 分离菌株的系统发育分析
使用NCBI数据库的BLAST程序进行序列比对的结果表明所获8 株分离菌株的16S rRNA基因序列与枯草芽孢杆菌的不同菌株显示最高的相似性均为100%。虽然与纳豆芽孢杆菌为同一物种，但是这些同源性较高的菌株中没有检索到纳豆芽孢杆菌。
因此本研究采用16S～23S ITS区域进行系统进化分析，结果表明所获8 株分离菌株的ITS基因序列与能产纳豆的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）菌株具有较高的亲缘关系（93%～97%），所获菌株HN48、HN67、TC100、HN10、TC103、HN72、3 株来源于市售纳豆发酵剂中纯化的纳豆芽孢杆菌（MG、KT、NR）和已知的纳豆芽孢杆菌菌株（B. subtilis natto AP011541和CP014471）序列的相似性较高（96%）。其中HN35、DC21与已知的纳豆芽孢杆菌和市售纳豆发酵剂中纯化的纳豆芽孢杆菌（MG、KT、NR）都不在同一簇，有可能是与已知纳豆芽孢杆菌进化水平不同且中国特有的纳豆芽孢杆菌菌株。
3 分离菌株纳豆粗酶液中的纳豆激酶活性
使用纤维蛋白平板法测定纳豆粗酶液中的纳豆激酶活性。不同浓度尿激酶和不同菌株发酵的纳豆粗酶液在纤维蛋白平板上反应后都可见不同大小的溶解圈。尿激酶标准曲线为y=8.103 4x－909.02（R2=0.995 4），根据标准曲线计算所获菌株发酵的纳豆粗酶液的纳豆激酶活性。
结果显示，所有样品中，纳豆粗酶液中纳豆激酶活性最高的菌株是市售纳豆芽孢杆菌株MG和KT，活性分别为731 U/mL和898 U/mL；本研究从腾冲家庭自制豆豉中筛选到的2 株纳豆芽孢杆菌TC100和TC103的纳豆粗酶液中纳豆激酶活性最强，分别为550 U/mL和519 U/mL；从玉溪稻草中筛选到的纳豆芽孢杆菌DC21发酵的纳豆粗酶液纳豆激酶活性为483 U/mL；从河南豆酱中筛选到发酵纳豆粗酶液中纳豆激酶活性较高的菌株是HN67和HN72，活性分别为299 U/mL和231 U/mL；除HN10、HN48、HN35，其他菌株发酵的纳豆粗酶液的纳豆激酶活性都高于市售纳豆芽孢杆菌株NR。HN10和HN48获得的纳豆粗酶液的溶解圈面积较小，超出标准曲线的有效范围，但肉眼能明显观测到它们的溶解圈（图3）。
4 分离菌株的纳豆发酵及感官评价
所获8 株菌株均能成功发酵纳豆（图4），经过感官评价，结果显示HN48、TC100菌株试制的纳豆的感官评价分数最高，均为19 分，和市售纳豆纳豆芽孢杆菌菌株（MG、KT、NR）发酵的纳豆（感官评分20 分）感官差异较小，发酵的纳豆有纳豆香味、合成黏液多，拉丝长（30～40 cm），口感滑润。
讨 论
本研究根据纳豆芽孢杆菌具有产蛋白酶、γ-PGA、纳豆激酶和生物素缺陷4 个筛选指标，从河南豆酱、腾冲豆豉和玉溪稻草样品中的326 株产芽孢菌株中筛选到8 株：HN72、HN10、HN48、HN35、HN67、TC100、TC103、DC21。本研究根据纳豆芽孢杆菌特性的4 个筛选指标，从不同地区的传统发酵豆制品和稻草中的产芽孢菌株中筛选到8 株具有纳豆芽孢杆菌特征的菌株，并都能用于生产纳豆。根据分离菌株的形态特征和ITS序列分析鉴定了所获8 个菌株为枯草芽孢杆菌的纳豆芽孢杆菌亚种 （B. subtilis natto）。枯草芽孢杆菌种内16S rRNA基因序列相对保守，通常很难用于区分物种内的不同表型性状的菌株。
本研究采用ITS序列分析分离菌株与枯草芽孢杆菌种群内的系统发育关系，将采用16S rRNA不能区分的种内关系有效区分出来，结果显示所筛菌株均是纳豆芽孢杆菌。本研究筛选的纳豆芽孢杆菌都具有产纳豆激酶和发酵大豆生产纳豆的能力，根据其大豆发酵产物中纳豆激酶活性，来源于云南省腾冲市家庭自制豆豉的TC100和TC103菌株的纳豆激酶活性最高，分别为550 U/mL和519 U/mL。而来源于河南省新乡市家庭自制豆酱的HN48和云南省腾冲市家庭自制豆豉的TC100菌株，发酵大豆所得纳豆的感官评价最高，评价分数均是19 分。本研究筛选得到的8 株菌株中TC100菌株是高产纳豆激酶的纳豆芽孢杆菌，有望作为纳豆生产的候选菌株。
