酵母作为大曲微生物区系中最重要的类群之一，对大曲品质有决定性的影响。因此，西华大学微生物研究所和四川省高校食品生物技术重点实验室的向慧平、林宜锦和关统伟*等人通过纯培养分离技术监测四川浓香型大曲整个制曲过程中酵母菌、芽孢杆菌的动态演化以及相应的动态工艺指标，科学分析它们之间的关联特性，为优质大曲的酿造和大曲自动化制备及其改良提供科学依据。同时，明确大曲的成熟期与品质下降期，从而更好地指导酿酒生产。
1 可培养酵母菌和芽孢杆菌的分离与动态变化
从11 个样品中分离得到342 株纯培养物，其中酵母菌194 株，芽孢杆菌148 株。结合形态学和分子生物学鉴定对菌株排重。结果表明，所有的序列与数据库中已有序列的相似度都大于97%。依据分析结果将194 株酵母鉴定归属于子囊菌门（Ascomycota）和担子菌门（Basidiomycota）的9 个属（Candida、Pichia、Millerozyma、Saccharomyces、Kazachstania、Wickerhamomyces、Kluyveromyces、Rhodotorula、Jaminaea）。子囊菌门的7 个属（Candida、Pichia、Millerozyma、Saccharomyces、Kazachstania、Wickerhamomyces、Kluyveromyces）都集中在酵母菌目（Saccharomycetales），包含有10 个典型代表菌株，即异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus）、马克思克鲁维酵母（Kluyveromyces marxianus）、酿酒酵母（Saccharomy cecerevisia）、近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis）、东方伊萨酵母（Issatchenkia orientalis）、拟郎比可假丝酵母 （C. pseudolambica）、热带假丝酵母（C. tropicalis）、膜璞毕赤酵母（Pichia membranifaciens）、Millerozyma acaciae和少孢哈萨克斯坦酵母（Kazachstania exigua）；而属于担子菌门的2 个属各自均只有一个典型菌种，分别为胶红酵母（Rhodotorula mucilaginosa）和Jaminaea angkorensis。
从酵母的整体分布上看，大曲发酵前期（0～3 d），虽然只分离得到8 株酵母，但是它们分别属于5 个不同的种，表明此时酵母的多样性较高而丰度不够。在发酵中期（9～15 d），酵母数量和种类相对稳定，仅分离出10 株酵母菌，而发酵前期R. mucilaginosa未被分离到，显然此时期高品温对大曲酵母存在显着的抑制作用。发酵后期（30 d）酵母的多样性和丰度显着增高，分别获得9 个酵母菌种，含48 株纯培养物。在贮存期前期（60～120 d），酵母的多样性和丰度仍保持微弱增长趋势，而在贮存后期（180～360 d）酵母菌的多样性和丰度显着下降，贮存期结束时（360 d）仅分得4 个酵母菌种的9 株纯培养物。
148 株芽孢杆菌被鉴定为8 个种，分别为枯草芽孢杆菌（B. subtilis）、贝莱斯芽孢杆菌（B. velezensis）、弯曲芽孢杆（B. flexus）、暹罗芽孢杆菌（B. s i a m e n s i s）、蜡质芽孢杆菌（B. cereus）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）、巨大芽孢杆菌（B. megaterium）和霍内克芽孢杆菌（B. h o r n e c k i a e）。在发酵期芽孢杆菌的多样性和丰度一直处于较高水平，而在贮存期时芽孢杆菌的多样性和丰度一直保持下降趋势，其中 B. licheniformis在所有样品中都存在，而B. subtilis的菌株数量最多，占到31.08%。虽然在11 个样品中分离的芽孢杆菌数量有较大的变化，但是芽孢杆菌类群一直保持着丰富的多样性。
2 大曲理化指标变化
浓香型大曲生产过程中最重要的控制条件是堆芯温度、水分和酸度，实际生产中通常用这3 个条件控制曲房培菌期的生产状况；此外，淀粉也揭示了大曲生产过程中主要的能量代谢情况。结果显示，曲块堆芯温度在培菌期前3 d快速增加至49 ℃，并在第9天升到最高温度60 ℃，达到中高温大曲的顶温范围，随后堆芯温度缓慢降低，直至第15天仍有55 ℃。水分是大曲生产过程中另一个关键点，在培菌期前15 d快速降低至16.27%，损失了17.55%的水分，而在之后的15 d损失了3.01%的水分，培菌期结束时仅为13.26%；在贮存期水分略有降低，但是变化不显着。大曲的酸度在培菌期前3 d由0.16 mmol/10 g快速增加至1.77 mmol/10 g，酸度升高主要是由产酸微生物在大曲中进行有机酸代谢，酸度在第15天快速下降至0.96 mmol/10 g；而在培菌期稳定在1 mmol/10 g左右。淀粉作为最主要的碳源，其变化趋势直接表征了大曲生产过程中微生物的能量代谢状况。11.39%的淀粉在发酵前15 d被利用，2.70%的淀粉在发酵后15 d被利用，而整个贮存期则有9.10%的淀粉被利用。
3 大曲质量指标的变化
结果显示，液化力与糖化力变化趋势大致一致，都在培菌前期快速增加后小幅下降，接着在培菌中后期又逐渐回升，而在贮存期总体上呈下降趋势。液化力在第9天达到最大值2.17 g/（gg h），第9～15天逐渐下降至1.09 g/（g?h），在培菌中后期又逐渐上升至1.27 g/（g?h），而在贮存期，液化力一直下降，结束时仅剩0.72 g/（g?h）。糖化力在前9 d快速增加至447.22 mg/（gg h），接着缓慢下降至 425.76 mg/（g?h）（第15天），随后缓慢增加至贮存期第180天的477.61 mg/（g?h），而在贮存期的第181～360天，大曲损失了180.84 mg/（g?h）的糖化力。
结果显示，培菌期前9 d酯化力和发酵力快速升高，培菌期第0天样品的酯化力和发酵力分别为31.52 mg/（50 g·7 d）和0.28 g / （ 0.5 g·7 2 h ），第 9 天分别升高至738.58 mg/（50 g·7 d）和1.02 g/（0.5 g·72 h）。随后酯化力持续增加，在贮存期第 9 0 天时高达944.57 mg/（50 g·7 d），而在贮存期的第181～360 天，酯化力快速下降至475.66 mg/（50 g·7 d）。不同的是，发酵力在培菌期第9～15天快速下降后又缓慢回升，培菌期结束时逐渐稳定在1.13 g/（0.5 g·72 h），发酵力在贮存期呈缓慢降低的趋势，贮存期结束时为0.69 g/（0.5 g·72 h）。同样在整个贮存期的第90～180天，4 个质量指标都趋于稳定并处于较高水平，而在贮存期的第180～360天却大幅下降，综合考虑，本研究所用大曲在生产周期第90天后品质达到稳定成熟；生产周期第90～180天为大曲最佳使用期。
4 浓香型大曲生产中工艺指标与酵母菌和芽孢杆菌类群的关联性分析
了解大曲中起主要作用的酵母菌和芽孢杆菌与关键指标的关联性极其重要。RDA（图3）展示，堆芯温度、水分和淀粉含量与多种微生物类群负相关，其中与B. velezensis、 C. parapsilosis、J. angkorensis、K. marxianus和 S. cerevisiae呈现显着的负相关（P＜0.05）。酸度与B. siamensis、B. licheniformis和B. cereus显着正相关 （P＜0.05），表明这3 株芽孢杆菌可能具有良好的产酸或耐酸能力。4 个质量指标之间本身具有较强的正相关，其中B. horneckiae和B. subtilis与液化力具有显着的正相关（P＜0.05）；K. exigua和C. tropicalis与酯化力、糖化力具有显着的正相关（P＜0.05）；W. anomalus和B. megaterium与发酵力具有显着的正相关（P＜0.05），表明这6 株菌是潜在的功能菌，对大曲的品质起着重要影响。
讨 论
本研究旨在多角度系统分析四川浓香型大曲整个生产周期中酵母菌和芽孢杆菌多样性变化，并结合理化指标和质量指标，探索浓香型大曲关键性微生物类群中的酵母菌和芽孢杆菌在大曲品质形成中的作用。本研究发现四川浓香型大曲在第90～180天期间品质稳定成熟，是酿酒最好的使用期。成熟后的大曲糖化力、液化力、酯化力和发酵力都达到行业标准，其中第90天时发酵力高达1.15 g/（0.5 g?72 h）；同时酯化力在第90天时最高为944.57 mg/（50 g?7 d），也远超行业标准的最低酯化力150 mg/（50 g?7 d）。大曲在第180天后质量开始剧烈下降，其中糖化力与酯化力下降幅度最大。因此，贮存6 个月后的大曲由于品质的下降，应加强贮存方法的改进，延长其高品质期；同时，在未来酿酒过程中应加强与新成熟大曲的混用，弥补其不足。当然，由于贮存条件、制曲工艺和区域生态环境的差异，应实时检测大曲质量，更好地指导酿酒生产。
与以往研究相比，首次在浓香型大曲中分得J. angkorensis和B. velezensis。在本研究中枯草芽孢杆菌同样为优势菌，而扣囊复膜孢酵母并未分离得到，我国白酒制曲是开放式自然制曲，存在大曲的品质与微生物群落的不稳定性，进而影响白酒的品质与稳定性。
RDA结合工艺指标对大曲酵母菌和芽孢杆菌类群类群演化进行关联性分析，发现了6 种关键微生物类群，分别是3 种酵母菌（K. exigua、C. tropicalis和 W. anomalus）和3 种芽孢杆菌（B. horneckiae、B. subtilis和B. megaterium），它们分别与4 个质量指标显着正相关，这将为未来开发纯种制曲提供科学依据。此外，B. cereus、B. licheniformis和B. siamensis与酸度显着相关。关联性分析发现4 个质量指标与堆芯温度都没有显着相关关系，在浓香型大曲生产工艺优化时应更全面了解这种间接作用。
本研究在分析大曲生产过程中酵母菌和芽孢杆菌类群演替的基础上，结合工艺指标检测，揭示了大曲生产过程中酵母菌和芽孢杆菌类群受理化因子的调控作用以及对大曲品质的影响，这将为大曲生产工艺中控温、控水、排酸，优质大曲的酿造和大曲自动化制备与改良提供很好的科学参考。然而大曲微生物类群是一个完整的共生体，酵母菌和芽孢杆菌发挥作用离不开其他微生物的存在。
本研究直接将酵母菌和芽孢杆菌从大曲微生物菌系中剥离出来，不考虑与其他微生物类群的相互作用，如霉菌、醋酸菌、乳酸菌和放线菌等，是对大曲微生物类群调控和功能作用的浅层研究。采用更全面的微生物多样性分析技术，研究大曲生产过程中微生物类群受理化因子的调控作用以及对大曲品质的影响，将是未来更好地理解大曲发酵原理的新思路。
