有报道显示乳酸菌作为肠道益生菌，可直接在肠道发挥抗氧化作用，通过维持肠道氧化还原平衡状态来维持肠道健康，但是乳酸菌的不同菌种或不同菌株间的特性存在显着差异。筛选出抗氧化活性高且耐受能力强的菌株对于扩大具有我国自主知识产权的益生菌菌库、增强发酵食品的功能性具有重要的意义。
目前国内外已有报道表明对丙烯酰胺导致的肠道上皮细胞损伤具有保护作用的活性物质主要是具有抗氧化活性的天然化合物，而乳酸菌是否具有该保护作用尚未见报道。因此，食品质量与安全北京实验室、农产品有害微生物及农残安全检测与控制北京市重点实验室和北京农学院食品科学与工程学院的李桐、吴思琪和金君华*等人对发酵米粉中的乳酸菌进行分离后通过体外抗氧化模型实验进行筛选，检测菌株清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基的抗氧化能力，探讨DPPH自由基清除能力强的菌株——植物乳杆菌GBE17、唾液乳杆菌GBE29对丙烯酰胺所致肠上皮Caco-2细胞氧化损伤的保护作用，并对其胃肠道胁迫环境耐受能力进行评价，以期获得对丙烯酰胺诱导肠上皮细胞氧化损伤具有保护作用的潜在益生菌菌株。
1 乳酸菌的DPPH自由基清除能力
结果显示，不同试验菌株的DPPH自由基清除能力之间具有差异，同一株菌不同组分的清除能力也具有显着区别，发酵上清液的抗氧化能力均比无细胞提取物强，表明本研究试验菌株中具有DPPH自由基清除能力的活性物质主要为胞外代谢产物，分布在发酵上清液中。为了排除培养基质对实验结果的影响，本研究也对MRS培养基的DPPH自由基清除率进行测定，表明其不具有显着的抗氧化性。
菌株发酵上清液清除率测定结果显示：植物乳杆菌GBE17（89.44%）、唾液乳杆菌GBE29（79.24%）＞植物乳杆菌N1大（36.53%）；而在破碎细胞的抗氧化能力上，植物乳杆菌GBE17（82.54%）＞植物乳杆菌N1大（30.34%）＞唾液乳杆菌GBE29（17.15%）。由此推断，发酵上清液与破碎细胞的抗氧化能力二者之间不存在直接相关性，在同一菌属下的不同菌株在抗氧化的能力上也存在显着性的差异，乳酸菌抗氧化能力的强弱与其所在菌属无相关性。本研究中植物乳杆菌GBE17（89.44%）和唾液乳杆菌GBE29（79.24%）的DPPH自由基清除能力均显着高于其他18 株菌。
2 16S rDNA序列分析
菌株GBE17和GBE29扩增后得到1 600 bp左右的DNA序列。将结果在NCBI数据库中比对并构建系统发育树。由系统发育树可知，菌株GBE17与L. plantarum strain KAI9（KM485570.1），GBE29与 L. salivarius strain L5（KP317678.1）有最接近的亲缘关系，相似度达到99%。
3 模拟胃肠道的耐受性评价
乳酸菌作为益生菌，需要有较好的耐酸性才能在肠胃中存活并发挥其益生菌作用。因此，选取pH值在3.0、2.5的环境下进行实验，选取胆盐质量分数为0.05%、0.10%的环境进行实验，同时，为了更好地观察乳酸菌的耐受能力，将处理时间延长到4 h，每隔1 h进行一次平板计数。结果显示，3 株菌在pH 6.5的条件下，经过4 h的培养，菌落数均有显着增加，存活数均高于109 CFU/mL，可见该pH值条件适合乳酸菌的生长。在低pH值和高胆盐浓度的培养条件下，经过4 h，3 株菌的存活数均高于107CFU/mL，可见试验菌株仍能够耐受一定的胃液酸度和胆盐浓度，在胃肠道内存活并定植，发挥良好的益生功能。
4 植物乳杆菌GBE17和唾液乳杆菌GBE29对丙烯酰胺诱导Caco-2细胞损伤的保护作用
4.1 丙烯酰胺浓度对Caco-2存活率的影响
采用浓度为0.0（空白对照组）、1.25、2.5、5.0、10.0、20.0 mmol/L丙烯酰胺处理Caco-2细胞24 h，构建氧化损伤细胞模型，结果显示，1.25 mmol/L丙烯酰胺处理24 h可刺激细胞的增殖。2.5、5.0、10.0 mmol/L及20.0 mmol/L的丙烯酰胺均可对Caco-2细胞造成不同程度的损伤，表现在Caco-2存活率降低，且存活率与丙烯酰胺呈剂量相关性变化。经计算可得，丙烯酰胺对Caco-2细胞的半致死剂量约为9.80 mmol/L，因此本实验选取9.80 mmol/L丙烯酰胺作为最佳诱导浓度，构建Caco-2氧化损伤模型，此时细胞存活率为50%。
4.2 试验菌株对氧化损伤的细胞形态学的影响
由图5可见，正常的Caco-2细胞贴壁生长，细胞形态呈铺路石状，无接触抑制，密度均匀。经9.80 mmol/L丙烯酰胺作用24 h后，部分细胞漂浮，细胞出现皱缩、变圆或椭圆形，折光率增强，细胞成团或簇状分布，表明细胞受到严重不可逆的损伤。植物乳杆菌GBE17上清组和干预组对Caco-2细胞造成的损伤程度较模型组明显减小，细胞形态更为正常，大部分细胞贴壁，皱缩程度减轻，密度均匀。由此可知，植物乳杆菌GBE17上清组和干预组均可保护细胞膜的完整性，减轻丙烯酰胺所致Caco-2细胞的氧化损伤。
值得注意的是，形态学方法无法观察到乳酸菌上清组与干预组以及各菌株之间的显着差异，且乳酸菌完整菌体组因乳酸菌菌体的干扰，无法观察到Caco-2细胞，因此具有一定的局限性。为了进一步探究不同乳酸菌及其发酵产物对Caco-2细胞抗氧化损伤的干预及保护作用，对细胞培养上清液、细胞裂解液中的抗氧化物酶和抗氧化物质进行测定。
4.3 细胞培养上清液及细胞裂解液的抗氧化活性
针对胞外上清液中LDH测定结果显示，氧化损伤组中Caco-2上清液LDH活性（12.22 U/L）显着高于空白对照组（1.11 U/L），表明9.80 mmol/L的丙烯酰胺对Caco-2细胞造成了损伤，破坏了细胞膜结构，胞内LDH释放到上清液中，模型建立成功；VC阳性对照组、乳酸菌治疗组（除去GBE29上清组）及干预组均显着低于氧化损伤组，表明乳酸菌可以保护丙烯酰胺所致的Caco-2细胞氧化损伤。
针对Caco-2胞外上清液的SOD、CAT测定结果显示，乳酸菌治疗组活细胞组＞乳酸菌干预组＞乳酸菌治疗组上清组，这些处理组的SOD、CAT活性不仅显着高于模型损伤组（0.55、0.05 U/mL），还显着高于阳性对照组（1.04、0.14 U/mL）及空白处理组（1.88、3.03 U/mL）。其中，乳酸菌治疗组中GBE17及GBE29活细胞的SOD活性分别高达9.62 U/mL和8.77 U/mL，CAT活性分别高达4.14 U/mL和4.67 U/mL。
对于同一株菌而言，乳酸菌治疗组中，各菌株活细胞的SOD、CAT水平显着高于各对应菌株的上清液组。对于不同菌株而言，SOD水平的高低不能反映CAT水平的高低，如乳酸菌干预组中，GBE17的SOD水平显着低于GBE29，但CAT水平却高于GBE29。针对Caco-2胞外上清液的非酶抗氧化物质GSH测定结果显示，乳酸菌治疗组中GBE17和GBE29的活细胞组显着高于氧化损伤组（1.35、1.14 μmol/L）。上清组中，GBE29的GSH水平虽然小于氧化损伤组，但差异不显着，不具有统计学意义（P＞0.05）。乳酸菌干预组中GBE17和GBE29的GSH水平（2.54、2.23 μmol/L）显着高于氧化损伤组（1.35 μmol/L）。同时研究发现，在乳酸菌治疗组中，GBE17上清组的SOD、CAT和GSH水平高于GBE29，LDH水平低于GBE29，这与GBE17的体外DPPH自由基清除率高于GBE29相吻合，提示体外DPPH自由基清除率可能反映体内的抗氧化酶和抗氧化物质水平，关于其具体的关系需要进一步地探讨。
为了检测胞内抗氧化物质和酶活的变化，对各处理组中细胞裂解液进行测定。针对细胞裂解液中的SOD测定结果显示，GBE17和GBE29治疗组及预防组均显着高于氧化损伤组。针对CAT测定结果显示，虽然GBE17、GBE29完整菌体组和GBE29上清组的水平低于氧化损伤组，但差异不显着，不具有统计学意义（P＞0.05）。结果表明，当细胞受到氧化损伤时，GBE17和GBE29能够通过提高胞内抗氧化酶SOD活性，减轻丙烯酰胺造成的细胞氧化损伤。
针对非酶抗氧化物质GSH测定结果发现，GBE17、GBE29完整菌体组和GBE29上清组均显着低于氧化损伤组（P＜0.05）。已有研究表明，当受到酸、冷胁迫时，细胞通过消耗少量的GSH抵御胁迫，因此推断当细胞受到氧化胁迫时，GSH同样以“自杀式”消耗方式发挥其在胁迫条件下的保护作用，关于GSH在氧化胁迫条件下发挥其作用方式的具体机制还需更深入地研究。不能判断何种方式对细胞的保护效果最佳。
综上所述，当细胞受到丙烯酰胺诱导的氧化损伤时，GBE17的治疗组与干预组和GBE29的干预组均可降低LDH的释放，提高细胞内外抗氧化酶SOD、CAT活性。可能通过消耗部分非酶抗氧化物质GSH保护氧化损伤的细胞，体外DPPH自由基清除率结果可能反映出体内的抗氧化酶和抗氧化物质水平。
结 论
本研究通过测定不同乳酸菌的无细胞发酵上清液及细胞内容物的DPPH自由基清除率，筛选出2 株抗氧化能力强的菌株，为植物乳杆菌GBE17和唾液乳杆菌GBE29，其自由基清除能力远高于ATCC标准菌株。细胞形态观察及细胞内外的抗氧化物活性测定结果表明，丙烯酰胺可以导致肠上皮细胞的氧化损伤，GBE17的治疗组与干预组和GBE29的干预组均可降低LDH的释放，提高细胞内外抗氧化酶SOD、CAT活性。同时两株乳杆菌在pH 3.0和胆盐质量分数0.1%的环境下处理4 h，存活数均高于107 CFU/mL，综上所述，植物乳杆菌GBE17和唾液乳杆菌GBE29对丙烯酰胺引起的细胞氧化损伤具有明显的抑制作用，能够改善丙烯酰胺导致的肠道损伤。本研究结果为预防和缓解丙烯酰胺致毒提供了新的思路和方法，同时为开发功能性乳酸菌提供一定的科学依据。
