对接种发酵过程中酿酒酵母的菌株区分可以揭示野生酵母与接种的酵母的竞争关系和消长变化，有效控制发酵过程。宁夏大学葡萄酒学院的孙悦、张军翔*和湖北省酵母功能重点实验室的张方方等人利用WLN营养琼脂培养基和分子分析技术，研究了不同嗜杀特性的酿酒酵母菌株对赤霞珠葡萄酒精发酵过程中酵母菌群体及其数量影响，探索发酵过程中微生物之间的相互作用，为良好、健康的葡萄酒发酵提供参考依据。
1 不同酿酒酵母菌株的发酵曲线
本研究采取CO2失重法监控不同发酵的发酵进程，接种不同酵母菌株的发酵曲线（CO2累计释放量表示）显示，接种发酵（10 d）比自然发酵（15 d）快5 d发酵结束。接种发酵在启酵和发酵速度上均快于自然发酵，敏感菌株UCD522和嗜杀菌株UCD2610的发酵速度最快，中性菌株NXU17-26次之，而自然发酵的发酵速度最慢。对于自然发酵而言，葡萄醪中的酵母菌主要来源于葡萄果皮，而这些酵母主要为非酿酒酵母，非酿酒酵母的发酵能力较酿酒酵母的弱，且对酒精的耐受性更低，因此，发酵的时间比接种酿酒酵母的发酵时间长。
2 发酵结束后的理化指标
结果显示，各发酵处理均能发酵完全（残糖＜4 g/L）， 且各理化指标均差异不显着。由于本研究选用的是同一批次的葡萄原料进行的发酵研究，各发酵中的起始糖浓度、酸浓度和pH值等理化指标无显着差异，所有发酵均顺利完成。因此，并未造成发酵后的葡萄酒中残糖、总酸质量浓度和乙醇体积分数等理化指标存在显着差异。
3 不同发酵中酵母菌种类的差异
3.1 WLN初步聚类分析
WLN营养琼脂培养将赤霞珠葡萄发酵过程分离到的480 株酵母菌的颜色和形态进行聚类分析，对WLN琼脂培养基上酵母菌落颜色以及形态的描述，将分离到的480 株酵母菌分为7 个不同的培养类型。结果表明，类型2的数量最多，占分离自总菌株的62.71%，其次是类型4和类型5，分别为69 株和70 株。
3.2 26S rDNA D1/D2区测序分析
结果显示，表明赤霞珠发酵过程中的酵母菌有4 属5 种，分别为葡萄汁有孢汉逊酵母（Hanseniaspora uvarum）、克鲁维毕赤酵母（Pichia kluyveri）、伯顿丝孢毕赤酵母（Hyphopichia burtonii）、酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）和库徳毕赤酵母（Pichia kudriavzevii）。不同发酵处理的酵母菌种类也不同，接种酿酒酵母的发酵中酵母多样性低于自然发酵，各接种发酵处理之间酵母多样性无差异。结果表明，自然发酵过程中共分离出酵母菌4 属5 种；接种发酵中分离出酵母菌均为2 属2 种：H. uvarum和S. cerevisiae。
结果显示，在发酵的各时期，自然发酵中的酵母菌数量相对较高。接种嗜杀酵母UCD2610的发酵，在发酵的第5 天酵母菌的数量达到最大值 （28.4±6.58）×106 CFU/mL；其余发酵中酵母菌的数量，均在发酵第3天达到最大值。结果显示，不同发酵处理的酵母菌种属组成也存在明显的差异，自然发酵中非酵母属的比例较其他发酵的高。随着发酵的进行，各发酵中非酵母属酵母的比例下降，酿酒酵母逐渐占主导地位并完成酒精发酵；在发酵中后期，接种嗜杀酵母UCD2610的发酵中，非酵母属酵母的数量较其他发酵的低。
4 发酵过程中酿酒酵母菌株多样性分析
本研究对不同接种条件下各发酵时期的酿酒酵母（类型G4、类型G5和类型G7，共165 株）进行了Interdelta指纹图谱即不同基因型的分析，将分离到的165 株酿酒酵母鉴定为11 种基因型（如图4所示G1～G11）。自然发酵中分离的18 株酿酒酵母表现出相同基因型（G1）（图4A）；接种中性菌株NXU17-26的发酵中分离出52 株酿酒酵母，表现出3 种基因型（G2～G5），其中G2（33 株）与NXU17-26具相同基因型（图4B），是发酵中的优势酵母，NXU17-26的基因型占比为63.46%；接种敏感菌株UCD522的发酵中共分离出47 株酿酒酵母，表现出3 种基因型（G6-G8），其中类型G8与接种的UCD522具相同基因型（图4C），菌株数为21（基因型占比为44.68%），其中G6类型的酵母16 株（基因型占比为34.04%）；接种嗜杀菌株UCD2610的发酵中共分离出51 株酿酒酵母，表现出4 种基因型（G9～G11），其中类型G9与所接种的UCD2610具相同基因型（图4D），菌株数为32（基因型占比为62.74%）。接种发酵中，接种的酿酒酵母在发酵中占主导地位，接种的敏感酿酒酵母占总酿酒酵母的比例较接种的其他两个酵母的低，这可能是因为发酵过程中野生酿酒酵母NXU18-15（G6）具较强的竞争力，影响了敏感酵母UCD522的生长。
5 UPGMA聚类分析
从图5可以看出，当欧式距离为0.50时，可将11 株酿酒酵母基因型分为5大类：第I类包括1 种基因型，为分离自自然发酵的基因型NXU18-01；第II和第V类，分别由分离自接种敏感菌株UCD522和嗜杀菌株UCD2610的发酵中的基因型组成；第III和第IV类，由分离自接种中性菌株 NXU17-26的发酵中的基因型组成。以上聚类结果显示，除个别菌株外（NXU28-28），分离自相同发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异性较小，而分离自不发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异性较大。
讨 论
本研究中分离到的酵母菌属于4 属5 种：葡萄汁有孢汉逊酵母、克鲁维毕赤酵母、H. burtonii、酿酒酵母和库徳毕赤酵母。本研究中，葡萄汁有孢汉逊酵母是最丰富的非酵母属酵母，其在发酵过程中可能有助于葡萄酒风味的形成，因此对其发酵特性及在葡萄酒酿造中的价值有待进一步研究。
本研究中，接种的酿酒酵母在发酵中均占主导地位，因此研究接种不同酿酒酵母发酵过程中酵母菌株及其演替规律很有必要。接种敏感菌株UCD522的发酵中，野生酿酒酵母NXU18-15表现出较强竞争力，通过对其酿酒特性的研究有望获得适于发酵的本土优良酵母菌株。此外，接种不同酿酒酵母菌株发酵过程的酿酒酵母菌株多样性差异明显。
我国大多数葡萄酒生产企业使用商业酿酒酵母即活性干酵母酿造葡萄酒，商业酿酒酵母对我国本土酵母菌资源的影响及其二者间的互作关系鲜见相关报道。本研究中，自然发酵未分离出与接种酵母相同的基因型。因此，亟需对我国本土酵母菌资源进行收集与开发。对自然发酵中分离的我国本土酿酵母菌资源进行分离、鉴定，可为后续优良本土酵母菌株的筛选奠定基础，保护我国本土酵母菌资源多样性。
结 论
本研究对接种不同嗜杀特性的酿酒酵母NXU17-26、UCD522和UCD2610的赤霞珠葡萄发酵中的酵母菌进行了分离鉴定和多样性研究。通过结合WLN和26S rDNA基因序列分析将其鉴定为4 属5 种。其中，自然发酵中葡萄汁有孢汉逊酵母为优势种，接种发酵中酿酒酵母为优势种。同时利用Interdelta指纹图普法和UPGMA聚类对酿酒酵母的菌株多样性进行了分析，结果显示，所接种的酿酒酵母是相应发酵中的优势菌，在接种敏感菌株UCD522的发酵中，野生酿酒酵母NXU18-15表现出较强的竞争力（基因型占比为34.04%），基因型占比仅次于UCD522（44.68%）。此外，分离自相同发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异性较小，分离自不同发酵中的酿酒酵母菌株间遗传差异性较大。
