在细菌和植物等模式生物中，叶酸合成和补救途径已经被广泛研究，并且在细菌和植物主要通过诱导相关基因高表达提高其叶酸产量。在乳酸菌中，Lactococcus lactis和Streptococcus thermophilus不能合成叶酸，研究发现，植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）能产生叶酸。产生叶酸的谷氨酸残基数量和产量主要取决于菌株本身和培养条件。在分析叶酸产量的研究中，大多关注在培养末期叶酸的最终产量，而很少研究在其培养过程中叶酸产量发生的变化，对这些过程进行深入了解对更好调控叶酸产量极为重要。
昆明理工大学生命科学与技术学院的李强坤、柳陈坚和李晓然*等人使用2 种基质发酵，研究不同基质对叶酸产生的影响。酸性条件下叶酸不稳定，pH值低于4.5时会完全分解；而碱性或中性条件下叶酸较稳定，因此，在本研究中，用1 株已发现的高产叶酸的L. plantarum 4-3对脱脂奶和豆浆两种基质进行发酵，通过调节其发酵过程中的pH值，探索不同发酵基质以及pH值对叶酸产量和合成叶酸相关基因表达量的影响。
L. plantarum 4-3发酵过程中生长特性
用脱脂奶发酵时，42 h的pH值降到最低，约为3.9（图1A）；而以豆浆为发酵基质时，12 h时pH值降到最低，约为4（图1B）。在本研究中，使用可以自动监测并调节pH值的发酵罐培养，在整个培养周期内pH值维持在6.0时，不仅延长了平台期，而且在较长时间内维持较高的活菌数。在没有调节pH值的情况下，L.plantarum达到稳定期后在较短时间内活菌数迅速减少（图1），结果表明，调节pH值保持在6.0可以使L. plantarum 4-3菌株细胞死亡速度降低，使培养基内的活细胞密度长时间维持在较高水平。此外，从菌株生长曲线可知，当以豆浆为发酵基质且维持pH 6.0时，L.plantarum 4-3达到稳定期的时间最短，且维持稳定期的时间最长，有利于次级代谢产物的产生。
L. plantarum 4-3叶酸产量
采用高效液相色谱-质谱联用仪对培养96 h发酵基质中的叶酸含量进行测定，结果显示，初始脱脂奶不含叶酸。由图1菌株生长曲线可知，以脱脂奶为发酵基质时，菌株生长缓慢，到达稳定期的时间较长，约24 h。随着发酵时间的延长，未控制pH值脱脂奶中仍未检测到叶酸。当控制pH值发酵时，36 h后叶酸开始积累，第60小时达到最大值，60 h后活菌数开始下降，叶酸含量也出现下降。
L. plantarum在生长过程中需要消耗叶酸，因此在培养过程中，L. plantarum首先消耗培养基中的叶酸继而自行合成供给细胞消耗。结果显示，初始豆浆中叶酸质量浓度约为1～2.5 ng/mL，随后叶酸含量下降，未控制pH值发酵时，第12小时叶酸质量浓度为0 ng/mL，随着发酵时间的延长也仍未检测到叶酸，而控制pH值发酵时，叶酸下降到第24小时开始逐渐累积。由于酸性条件下叶酸不稳定，pH值低于4.5时会完全分解；而碱性或中性条件下叶酸较稳定，因此，控制pH值可能减少了叶酸的降解，此外，控制pH值还可能促进叶酸的产生，所以，将通过验证叶酸相关合成基因的表达情况对此分析。
虽然L. plantarum 4-3发酵的脱脂奶和豆浆不能提供足够的叶酸，但可以作为天然叶酸的膳食补充剂。与其他L. plantarum野生型菌株相比，本研究发酵条件下，叶酸产量更高，尤其是在基因改造菌株难以直接进入食品的情况下，对其发酵条件进行调整和优化获得更多的生物合成叶酸产量极为必要。
L. plantarum 4-3合成叶酸基因表达量
为研究在培养过程中pH值对叶酸合成相关基因的影响，使用qPCR方法对叶酸生物合成过程中合成DHPPP和二氢蝶酸的主要基因进行定量检测。结果显示，在pH 6.0条件下，叶酸相关合成基因在脱脂奶和豆浆两种基质中的表达均显着提高，当维持pH 6.0时，叶酸分别在第36小时和第24小时开始积累，说明pH 6.0有利于叶酸的合成。维持pH 6.0发酵时，在脱脂奶和豆浆两种基质中folE基因表达量显着提高，但与其他基因相比其表达量相对较低，可能限制了叶酸的合成，folQ基因编码DHNTPase。结果显示，L. plantarum 4-3在两种基质中都具有较高的表达量，DHPS由folP基因编码表达。此外，DHPS催化合成的底物二氢蝶酸对DHPS有强烈的抑制作用，因此过量表达folP基因可能提高了二氢蝶酸的含量，但二氢蝶酸被竞争性地用于叶酸的合成和抑制DHPS的活性，两种反应竞争的结果导致叶酸的合成速度只能有限度增加。folP基因在两种基质中都有很高的表达量，但叶酸含量相对较低，也可能是由反馈抑制造成的。
叶酸合成的其他基因，如pABA合成通路上的相关基因，也与叶酸产量密切相关。pABA是叶酸的重要前体，较多叶酸合成的研究在培养基中额外添加pABA提高叶酸产率。后续研究将深入分析此支路对 L. plantarum叶酸合成的影响，为开发富含叶酸的发酵食品提供理论支持。
结 论
L. plantarum是应用广泛的益生菌，其可以合成叶酸的特性赋予了这类细菌更好的应用价值。乳酸菌叶酸相关合成基因数量很多，发酵条件对叶酸的合成影响很大。结果显示，与脱脂奶相比，用豆浆发酵能产生更多的叶酸。此外，L. plantarum在生长过程中持续产生有机酸使得培养基的pH值降低，将pH值稳定在6.0有利于细菌长时间保持高密度生长，在此条件下，叶酸合成相关基因也有较高的表达，大大提高了叶酸的生产水平。
