乳酸菌在实际应用中往往是各种胁迫同时出现，在某些单因素胁迫实验中，发现不同的胁迫之间似乎有某种关联。在冷冻干燥过程中，乳酸菌发酵剂难以避免冷冻与干燥过程对其造成的各种损伤。近年来常通过添加合适的保护剂，调整冷冻干燥工艺或者各种胁迫提高乳酸菌的存活率和活力，但是利用交叉保护提高乳酸菌在冷冻干燥过程中冷冻抗性方面的研究较少，因此探究运用交叉保护这一方法对于乳酸菌冷冻干燥活性的提高具有一定意义。
本实验室前期筛选出的发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）ATm具有滞后时间短以及酸化速率快的特点，能够缩短发酵时间、降低能耗，是1 株潜在的适合工业生产用的菌株，因此石河子大学食品学院和新疆植物药资源利用教育部重点实验室的杨婕、郭金凤和李宝坤*等人选用该菌株为研究对象。通过比较不同胁迫条件下细胞的冷冻干燥存活率，研究不同胁迫条件影响发酵乳杆菌冷冻干燥后活性的差异性，为高活性乳酸菌发酵剂的生产提供实验依据。
1 单因素胁迫对冷冻干燥存活率的影响
结果显示，经过胁迫后菌株冷冻干燥存活率均高于未经胁迫的对照组，说明酸、冷两种胁迫方式都能够不同程度提高发酵乳杆菌ATm存活率，使得冷冻干燥后的活菌数增加，其中pH 4.5与4 ℃胁迫下冷冻干燥存活率最高，分别为67.42%、44.66%。但并不是所有菌株都能通过酸胁迫增加冷冻抗性，罗伊氏乳杆菌I5007在pH 6.7的存活率与对照组pH 5.7相比提高了14.3%。10 ℃胁迫下冷冻干燥存活率仅为14.24%，与对照组相比存活率降低。pH 3.2时存活率与未经胁迫的对照组相比没有显着差异，可能是因为pH值太低使得菌株在胁迫时受损伤过大，导致存活率过低。因此选取pH 4.5、4 ℃作为交互胁迫的条件。
2 交互胁迫对冷冻干燥存活率的影响
结果显示，未经胁迫对照组冷冻干燥存活率为30.86%，而经过酸-冷交互胁迫处理后冷冻干燥存活率可以达到87.19%，是对照组的2.61 倍，且与单因素胁迫相比有显着差异（P＜0.05）。说明交互胁迫能够在冷冻干燥过程中对乳酸菌提供保护，且交互胁迫比单因素胁迫的处理方式更有效。这可能是因为乳酸菌常处于复杂的生长环境，使得乳酸菌在面临不同胁迫时产生了交叉保护，即乳酸菌在暴露于第1种胁迫期间所诱导的分子机制能够保护细胞免受之后的致死性攻击。这种交叉保护机制使得乳酸菌在交互胁迫处理后能够更好地抵抗冷冻干燥过程中的各种损伤。
3 交互胁迫对冷冻干燥发酵乳杆菌ATm酸化曲线的影响
对冷冻干燥后的乳酸菌进行酸化曲线测定可提供细菌修复损伤的能力和冷冻干燥后活性恢复的情况。菌株冷冻干燥并复水后，每小时测定细胞培养液pH值变化，选取胁迫处理菌株、未经冷冻干燥原始菌株和未经胁迫处理的冷冻干燥菌株（对照），得到菌株的酸化曲线（图3）。
结果显示，未冷冻干燥的原始菌株滞后时间最短，酸化速率（每小时pH值变化量）最快，分别为2.02 h、0.68。相反，未经胁迫处理的冷冻干燥乳酸菌滞后时间最长，酸化速率最慢，分别为7.50 h、0.23。任何处理下冷冻干燥后微生物的滞后时间都有不同程度的延长，且酸化速率减慢。经过交互胁迫处理后的乳酸菌滞后时间和酸化速率与原始菌株相近，分别为2.73 h、0.53，该处理比其他胁迫的保护方式更有效，说明用交互胁迫的前处理方式保护冷冻干燥乳酸菌的活性是很有必要的。
4 交互胁迫对冷冻干燥发酵乳杆菌ATm LDH活性的影响
LDH是乳酸菌冷冻干燥过程受损伤的关键酶，因此选择LDH进一步阐述交互胁迫对乳酸菌冷冻干燥的活性保护作用，结果显示，不同胁迫处理下LDH活性有显着差异。酸胁迫、冷胁迫以及交互胁迫与未胁迫对照组都具有显着差异（P＜0.05），LDH活性分别为0.043、0.038、0.074 U/104 cell。而未经过胁迫处理的冷冻干燥乳酸菌LDH活性为0.018 U/104 cell。LDH活性与存活率的变化一致，表明存活率的提高与LDH有关。
除此之外，酸-冷交互胁迫处理后的LDH活性相比于其他处理具有显着差异，且LDH活性明显高于其他处理组，这说明经过交互胁迫处理后的细胞的LDH活性在冷冻干燥过程中受损伤最小，能够保护乳酸菌细胞的活性。另一方面LDH能够在发酵过程中催化丙酮酸使其还原为乳酸，是乳酸菌代谢过程中的关键酶，LDH活性的大小反映了菌株的产酸能力，与3节一致，进一步说明交互胁迫能够保护LDH活性从而使得冷冻干燥乳酸菌的滞后时间和酸化速率与原始菌株相近。
5 交互胁迫对冷冻干燥发酵乳杆菌ATm ATP酶的影响
ATP酶是冷冻干燥过程中损伤的关键酶之一，本研究测定冷冻干燥后 Na+-K+ATP酶与Ca2+-Mg2+ATP酶的活性，结果显示，冷冻干燥后不同胁迫条件对冷冻干燥乳酸菌Na+-K+ATP酶与Ca2+-Mg2+ATP酶具有显着差异。对于3 种不同胁迫处理，交互胁迫和ATP酶活性的影响不同，其中酸-冷交互胁迫处理后，冷冻干燥发酵乳杆菌ATm的Na+-K+ATP酶与Ca2+-Mg2+ATP酶活性分别为2.254 5 U/mg和2.335 5 U/mg。而未经胁迫处理的 Na+-K+ATP酶与Ca2+-Mg2+ATP酶活性分别为0.756 U/mg和0.949 5 U/mg。一方面ATP酶在冷冻干燥过程中受到损伤，ATP酶的失活会使得冷冻干燥乳酸菌的活性降低，另一方面也说明交互胁迫能够保护ATP酶活性从而保护冷冻干燥乳酸菌的活性。
6 交互胁迫对冷冻干燥发酵乳杆菌ATm细胞膜完整性的影响
当荧光显微镜观察到细胞呈红色，说明细胞膜完整性被破坏。未经过胁迫的菌体冷冻干燥后几乎全部发出红色荧光，说明菌体冷冻干燥后的细胞膜完整性几乎全部被破坏（图6A）。然而，在经过酸胁迫与冷胁迫及未胁迫的细胞相比，发出绿色荧光的细胞数明显增多。其中交互胁迫处理 （图6D）后发与单因素胁迫处理（图6B、C）相比有显着差异，说明冷冻干燥过程破坏细胞膜的完整性而交互胁迫能够较好地维持细胞膜完整性。这也为之前交互胁迫能够保护ATP酶活性提供了直接证据，证明了交互胁迫在冷冻干燥过程中可以维持细胞膜的功能，从而可以保护ATP酶活性。
结 论
本实验采用交互胁迫的方法，以发酵乳杆菌ATm作为研究菌株，提高冷冻干燥后乳酸菌的存活率并保护其活性，结果表明在pH 4.5、4 ℃的酸-冷交互胁迫条件下能够使菌体的冷冻干燥存活率达到87.19%。酸-冷交互胁迫与对照组相比能够缩短滞后时间，提高酸化速率，保护LDH与ATP酶活性，很好地维持细胞膜完整性，有效保护乳酸菌冷冻干燥后的活力。研究结果表明交互胁迫为提高冷冻干燥存活率提供一种新方法，也为高活性乳酸菌发酵剂的生产提供实验依据。
