沈阳农业大学食品学院的孙悦、耿晓茜和李春强*等人以猪外脊肉提取的肌原纤维蛋白为研究对象，以羟自由基氧化系统为模型，研究焦磷酸钠（TSPP）对天然和氧化肌原纤维蛋白的MTG交联程度和蛋白凝胶性能的影响，以期阐明TSPP、氧化、MTG交联和蛋白凝胶性能之间的关系，为MTG及其他相似的交联酶类在肉制品中的应用提供一定的理论依据。
1. TSPP对肌原纤维蛋白氧化程度的影响
1.1 羰基含量分析
羰基是蛋白质氧化的标志性产物。结果显示，未氧化肌原纤维蛋白的羰基含量为1.51 μmol/g。蛋白质羰基含量与H2O2浓度呈正相关，随着H2O2浓度的增加，羰基含量显着增加（P＜0.05）。当H2O2浓度为20 mmol/L时，羰基含量比未氧化样品增加60.07%。经＋TSPP所有样品的羰基含量均低于－TSPP样品，特别当H2O2溶液浓度为1～10 mmol/L时，＋TSPP样品的羰基含量显着低于－TSPP样品。总体来看，随着H2O2溶液浓度的增加，＋TSPP样品增幅稍缓于－TSPP样品。
1.2 巯基含量分析
巯基含量下降是评估蛋白质氧化程度的重要依据。结果显示，无论是否添加TSPP，随着H2O2溶液浓度的增加，巯基含量均呈现下降趋势，当H2O2溶液浓度大于10 mmol/L时，巯基含量显着下降（P＜0.05），且＋T S P P 样品的巯基含量显着高于－T S P P 样品 （P＜0.05）。当H2O2溶液浓度达到20 mmol/L时， －TSPP处理样品的巯基含量下降了65.94%，＋TSPP处理的蛋白样品下降57.74%，可见TSPP对肌原纤维蛋白氧化具有一定的保护作用。从本研究的羰基和巯基结果可以看出，TSPP对肌原纤维蛋白氧化具有一定的保护作用。
2. TSPP对肌原纤维蛋白交联程度的影响
2.1 自由氨基含量分析
结果显示，肌原纤维蛋白的自由氨基含量随着H2O2溶液浓度的增加而显着降低（P＜0.05），这是因为赖氨酸的ε-NH2基团非常容易受到羟自由基攻击转化为羰基，而新生成的羰基又可能与NH2共价结合进一步降低自由氨基的含量，所以自由氨基含量的变化在一定程度上也可反映蛋白氧化程度。所有＋TSPP氧化样品（H2O2溶液浓度为1～20 mmol/L）的自由氨基的降低幅度显着小于－TSPP样品（P＜0.05），这可能是因为TSPP对肌原纤维蛋白氧化起到保护作用，这与羰基和巯基的结果相符。
自由氨基的降低量可以间接反映MTG交联反应的程度。结果显示，经MTG处理后，所有样品的自由氨基含量均显着下降（P＜0.05）。为了排除氧化的影响且只观察MTG交联程度，通过计算相同氧化条件下MTG交联前后自由氨基的相对降低量，可见自由氨基相对降低量随着H2O2溶液浓度增大出现先增高后降低的趋势，在H2O2溶液浓度为10 mmol/L时达到最大，特别是＋TSPP样品自由氨基降幅高达43.60%。总体来说，MTG交联后，＋TSPP氧化样品的自由氨基相对降低量高于－TSPP氧化样品，说明TSPP处理有利于MTG交联。只有在H2O2溶液浓度为1～5 mmol/L时＋TSPP氧化样品的自由氨基相对降低量才显着高于－TSPP氧化样品（P＜0.05），而当H2O2溶液浓度为10～20 mmol/L时二者差异不显着。
2.2 SDS-PAGE测定结果
由图4a可知，无论是否添加TSPP，随着H2O2溶液浓度增加，样品中肌球蛋白重链（MHC）逐渐减少，肌动蛋白条带变化不大。同时，浓缩胶上方有聚集体出现。当添加β-ME还原后（图4b），聚集体大部分消失，并且减少的MHC条带大多能够恢复到氧化前接近的水平。对比TSPP处理前后的电泳图（图4a），发现当H2O2溶液浓度小于5 mmol/L时，＋TSPP样品的MHC条带相对较粗，说明TSPP对蛋白氧化具有一定抑制作用，这与羰基（图1）、巯基（图2）和自由氨基（图3）的结果相符。然而，当H2O2溶液浓度达到10～20 mmol/L，－TSPP样品的MHC条带反而比相同氧化条件下＋TSPP样品的粗 （图4a），加入β-ME后（图4b），＋TSPP样品的MHC条带强度小于－TSPP样品的MHC条带强度，且浓缩胶上部的大分子聚集物反而比－TSPP样品的多。
对比图4a、c发现，MTG交联后，所有样品的MHC显着减少，且浓缩胶顶部的大分子聚集物浓度增加。添加β-ME后，图4d中浓缩胶顶部的聚集物也明显比图4b中多，可见这些聚集体是由MTG催化形成的异肽键ε（γ-谷氨基）-赖氨酸连接在一起的、不含二硫键的巨大分子。对比图4b、d还发现，＋TSPP样品的MHC和肌动蛋白条带明显比相同氧化条件下－TSPP样品的条带细，说明TSPP处理后，肌原纤维蛋白更容易发生MTG交联。这也正好印证了自由氨基的结果。
3. TSPP对肌原纤维蛋白凝胶特性的影响
3.1 动态流变学分析
G’越高，凝胶弹性越好。如图5A所示，随着温度升高，G’增长缓慢，此时肌原纤维蛋白间相互作用较弱。当温度升到40 ℃以后G’迅速增大，这是由于加热使肌原纤维蛋白变性，结构开始展开。未氧化样品的G’在46 ℃出现一个峰值，这是由于加热使肌原纤维蛋白间发生交联，尤其是肌球蛋白头部交联，呈现出弹性较好的结构。G’达到峰值后便逐渐下降，这很可能与肌球蛋白尾部解螺旋有关，导致蛋白流动性增加。而随着温度继续升高，蛋白质在二硫键、疏水作用、氢键等作用下重新相互作用加强，逐步形成不可逆的凝胶网络结构，因此G’继续升高。当温度接近75 ℃时，G’趋于稳定，这是由于肌原纤维蛋白逐渐形成了稳定的凝胶体系。
如图5A所示，当肌原纤维蛋白在无TSPP条件下氧化时，随着H2O2溶液浓度从1 mmol/L升至20 mmol/L，G’峰位置向温度低的方向偏移，且峰值逐渐降低。随着温度逐渐升至75 ℃时，所有样品的G’也呈逐渐上升的趋势。加入MTG交联后，G’峰值进一步增加，峰位置向温度低的方向偏移，这与MTG催化肌原纤维蛋白交联导致蛋白结构变化有关。相对于未交联样品，温度升至75 ℃时，G’显着增加。为了观察MTG交联作用对肌原纤维蛋白凝胶性能的影响，计算由MTG交联引起的G’增幅，发现其与氧化程度相关，即随着H2O2溶液浓度升高（1～20 mmol/L），G’增幅反而从30.32%逐渐降至14.07%，可见在无TSPP条件下MTG催化所引起的凝胶性能提高与氧化程度相关，即蛋白氧化抑制MTG交联所引起的凝胶性能的提高。
相对于－TSPP条件（图5A），在TSPP条件下，未氧化样品的G’峰位置向温度高的方向移动，出现在48.1 ℃，且峰值增大（图5B），这可能是由TSPP对S1部位氧化具有保护作用，抑制起始阶段蛋白的聚集，使变形温度升高约2 ℃。随着H2O2溶液浓度从1 mmol/L升至20 mmol/L， G’峰位置继续向温度低的方向偏移。MTG交联后，TSPP处理肌原纤维蛋白的峰值显着增大（P＜0.05）。加热至75 ℃时，＋TSPP样品（图5B）的G’明显高于－TSPP样品（图5A），可以看出，TSPP可以提高肌原纤维蛋白凝胶性能。但若扣除氧化所引起的凝胶性能变化，只观察在TSPP条件下MTG交联所引起的凝胶性能变化，发现在TSPP条件下随着H2O2溶液浓度升高（1～20 mmol/L），由MTG交联引起的G’增幅从75.19%逐渐降低至2.47%，变化十分剧烈。由此可见，相对于－TSPP样品，TSPP处理使蛋白氧化对MTG交联引起的凝胶性能提高具有更强的抑制作用。
3.2 凝胶强度分析
结果显示，所有蛋白凝胶样品随着H2O2溶液浓度的增加，凝胶强度均逐渐降低。这说明，氧化造成的肌原纤维蛋白结构变化，特别是大分子聚集物的生成，使凝胶空隙加大、结构松散，进而降低了肌原纤维蛋白的凝胶强度。整体而言，＋TSPP样品的凝胶强度显着高于 －TSPP样品（P＜0.05），可见TSPP处理会提高天然和氧化肌原纤维蛋白的凝胶性能。
添加MTG后，所有样品的凝胶强度均显着增加 （P＜0.05），且＋TSPP样品的凝胶强度显着高于 －TSPP样品（P＜0.05）。但是，由MTG交联引起的凝胶强度增幅不同，计算－TSPP以及＋TSPP两种条件下，MTG交联样品相对于未交联样品的相对增加量，可以看出在－TSPP和＋TSPP两种条件下由MTG交联引起的凝胶强度增幅均随H2O2溶液浓度增加逐渐降低（P＜0.05），虽然在＋TSPP条件下，未氧化样品的凝胶强度增幅高于－TSPP样品，但随着氧化程度增加反而降低速度更快，这与动态流变学结果（图5）相符。由此可推断，在－TSPP和＋TSPP两种条件下，蛋白氧化抑制MTG交联所引起的凝胶性能的提高，且在TSPP条件下抑制作用更剧烈。
3.3 持水性分析
结果显示，氧化蛋白凝胶的持水性随着H2O2溶液浓度增加而逐渐降低。＋TSPP蛋白凝胶的持水性显着高于同条件下－TSPP样品（P＜0.05），机制可能与磷酸盐使蛋白的pH值偏离等电点、解离肌动球蛋白等有关。然而，随着H2O2溶液浓度增加， ＋TSPP样品的持水性与－TSPP样品之间的差异越来越小，可见氧化会减弱TSPP提高凝胶持水性的作用。
M T G 交联后，所有凝胶持水性均显着增加 （P＜0.05）。由MTG交联引起的持水性相对增加量，可见－TSPP样品的持水性相对增加量随着H2O2溶液浓度增加逐渐减小（P＜0.05），而＋TSPP氧化样品的持水性相对增加量明显高于未氧化样品（P＜0.05），这表明TSPP和氧化共同作用反而有利于提高MTG交联后蛋白凝胶的持水性。
结 论
TSPP对肌原纤维蛋白氧化具有一定的抑制作用，但对MTG交联反应起到积极作用，且与氧化程度相关，这可能与TSPP改变肌球蛋白结构，进而改变MTG交联模式有关。总的来说，无论添加TSPP与否，氧化会导致肌原纤维蛋白凝胶性能下降，而MTG交联后均有所回升，其上升幅度与氧化程度和TSPP处理相关：在＋TSPP和－TSPP条件下，由MTG交联引起的凝胶性能增幅随着氧化程度的增加均降低，但在＋TSPP条件下降低速度更快。由此可知，相对于－TSPP样品，在氧化胁迫条件下TSPP对MTG交联引起的凝胶性能提高具有更强的抑制作用。总之，TSPP、氧化和MTG三者对肌原纤维蛋白凝胶性能的影响复杂，作用机制有待进一步研究。磷酸盐与MTG是肉制品中常见添加剂，探究二者的相互作用对肉制品加工及产品品质提高具有重要理论意义。
