胶原蛋白提取工艺流程
牦牛骨→去除残余肉及表面杂质→脱脂→乙二胺四乙酸脱钙→0.5 mol/L乙酸溶液提取（或0.5 mol/L的乙酸溶液以及1.6%胃蛋白酶提取）→盐析→离心→乙酸复溶→透析→蒸馏水透析→真空冷冻干燥
酸法提取
脱脂脱钙完全后，用0.5 mol/L的冰醋酸溶液以质量比1∶10溶解，振摇浸提1～5 d，收集上清液，采用盐析的原理使溶液中的胶原蛋白沉淀析出。向上述上清液中 加入Tris（6 g/L提取液），pH 7.5，调至最佳盐析浓度，搅拌均匀静置过夜后，4 ℃、10000 r/min离心30 min，将沉淀物冻干即得酸溶性胶原蛋白（acid-soluble collagen， ASC）粗品。通过3次重复实验，按下式计算胶原蛋白得率，ACS的得率为（2.24±0.3）%。
酶法提取
脱脂脱钙完全后，同时加入0.5 mol/L的乙酸溶液和 1.6%（按牛骨原料质量计）胃蛋白酶（1200 U/g）。牛骨与乙酸溶液质量比为1∶10，振摇浸提1～5d。收集上清液并加入Tris（6g/L提取液），调节pH 7.5，加热至90℃以上灭酶10 min，调至最佳盐析浓度，搅拌均匀静置过夜后，4℃、10000 r/min离心30min，将沉淀物冻干即得酶溶性胶原蛋白（pepsin-soluble collagen，PSC）粗品。通过3次重复实验，计算胶原蛋白得率，PSC得率为（3.32±0.4）%。
分析讨论
分析对比了酸法、酶法提取牦牛骨胶原蛋白的理化特性得出以下结论：采用酸法从牛骨中提取胶原蛋白得率是2.24%，酶法胶原蛋白得率是3.32%，酶法较酸法提取率提高了48.21%，但酶法提取的成本较高； 2种方法提取的胶原蛋白都含有其特征性氨基酸，且Gly 含量最多，PSC中氨基酸除Cys、Val、Met外，其他氨基 酸含量均高于ASC，故推测PSC的纯度可能相对较高； 酸法和酶法提取的胶原蛋白的紫外光谱基本一致，在 230 nm左右波长处有最大紫外吸收峰，且在280nm波长处未出现紫外吸收峰，说明牦牛骨ASC和PSC中均不含有Trp，是典型的胶原蛋白；研究表明胶原蛋白在水系中纤维的Ts可以反映其稳定性，Ts与胶原蛋白中亚氨基的含量呈正相关，本实验测得ASC和PSC的Ts分别为 40.12 ℃和40.94 ℃，这可能是由于ASC和PSC的分子特性和构型存在差异；红外光谱及SDS-PAGE显示提取的胶原蛋白主要由α、β、γ三种亚基组分组成，属于I型胶原蛋 白，且三股螺旋结构完整。ASC的γ链和β链较浅较细，α链条带相对浅细且无70 kDa以下的条带，可能是因为ASC的蛋白结构相对较为完整，含有较少小分子的水解胶原及多肽；牦牛骨ASC和PSC都保留了较为完整的纤维网状结构，两者呈现出相对统一规则的多孔网状结构，但酸法提取胶原蛋白结构分布相对均匀，推测其孔径的大小可能与制备过程中含水量有关。
