大连海洋大学食品科学与工程学院的李欣蔚、廖 佳、周 慧*等人对现有的分离和富集技术进行梳理总结，并阐述了各种方法的原理、适用对象、优缺点以及发展方向，以期为功能性肽的理论研究与开发利用提供参考。
1、功能性肽的分类
外源性功能肽
人体以外的功能性肽类统称为外源性功能肽。按照获得途径不同，可以分为蛋白质降解肽、其他生物体内天然肽和氨基酸合成肽。蛋白质降解肽是通过酶解、微生物发酵、化学或物理等方法将蛋白质降解为具有功能活性的肽类。
内源性功能肽
内源性功能肽是天然存在于人体内，参与人体代谢、运输、免疫、调节等各项生理活动的肽类，具有极其重要的作用，如神经肽、肽激素、生长因子、细胞内蛋白水解产物等，一般由3～50 个氨基酸构成。人体内的内源性功能肽分为两种：一是天然存在的肽段，例如生长因子，通常具有特定的生物活性；二是经体内蛋白质降解所得的肽段。
2、外源性功能肽的分离纯化
膜分离技术
膜分离不同于传统意义上的过滤，其可以在一定的分子质量范围内进行肽混合物的精准分离，是单纯的物理作用，具有操作简单、不影响样品活性、适用性强等特点。根据膜的孔径大小可以分为微滤膜、超滤膜、纳滤膜和反渗透膜等。目前，超滤技术已经普遍用于酶解产物的分级分离中。
电泳技术
在电场的作用下，带电粒子向着与之电荷相反的电极移动，称为电泳。电泳技术是基于电迁移的高性能分离技术，被广泛用于蛋白质的分离。高效毛细管电泳分离利用毛细管代替传统的电泳槽，效率提高了几十倍，并且具有快速、高分辨率的特点。用于肽分离的毛细管电泳有毛细管区带电泳、毛细管等速电泳、毛细管等电聚焦、毛细管凝胶电泳、亲和毛细管电泳、毛细管免疫电泳、芯片式毛细管电泳、阵列毛细管电泳等。
色谱技术
1）大孔树脂吸附层析
大孔树脂可将吸附和筛选相结合，利用各组分吸附力和分子质量大小不同进行分离。大孔树脂具有回收率高、选择性好、分离效率高、吸附条件温和等特点，广泛用于色素、多酚、生物活性肽等水溶性化合物的分离提纯。
2）凝胶过滤层析
凝胶过滤层析又称排阻层析或分子筛层析，根据分子质量的不同将各组分进行分离。常用的填料为聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖凝胶和葡聚糖凝胶。凝胶过滤层析的分离效果与截止尺寸、空隙体积和柱体积等因素密切相关，具有设备简单、过程简便、无化学变化等特点，广泛用于蛋白质、多糖等物质的分离纯化。
3）离子交换层析
离子交换色谱是依据样品各组分所带电荷不同，与固定相上的离子交换基团相互作用的程度不同实现组分分离的技术。吸附和解吸附是离子交换的两个主要步骤。离子交换色谱现已普遍应用于蛋白质、核酸、肽的分离纯化之中。
4）亲和层析
亲和层析一般用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖等大分子物质，依据生物分子与配体之间可逆且专一的结合能力进行分离，具有高选择性、高回收率的特点。亲和色谱可分为免疫亲和色谱、金属离子亲和色谱、拟生物亲和色谱（例如肽亲和色谱）。
5）反相高效液相色谱法
在高效液相色谱中，当流动相极性大于固定相极性时，即为反相高效液相色谱。反相高效液相色谱是根据样品与固定相之间的疏水作用差异进行分离。疏水作用弱或亲水的物质保留时间短，容易被排出，反之，疏水性相对较强的组分在柱内滞留时间较长。
3、内源性功能肽的富集
糖肽的富集
糖基化是重要的蛋白质翻译后的修饰之一，人体内约有一半以上的蛋白质会发生糖基化。研究发现糖基化会影响蛋白质空间结构及传导运输，且蛋白质糖基化程度及糖链的结构变化也是导致疾病（如癌变）发生的重要标志。糖肽的富集是糖基化研究的一个重要组成部分，也是肽组学研究的关键步骤之一。糖肽的富集方法主要有凝集素亲和法、肼化学法、硼酸化学法、亲水作用法等。
磷酸肽的富集
磷酸化肽的富集容易受到高丰度蛋白的影响。如何高效快速地富集磷酸化肽段是近年肽组学的研究热点。磷酸肽的富集方法主要有亲和色谱富集法、离子交换色谱法。
其他低丰度肽的分离方法
除了磷酸肽及糖肽，生物体内还有多种与生物体代谢及与生理活动密切相关的内源性功能肽。研究发现瓜氨酸化在自身免疫性疾病类风湿关节炎中发挥着关键性作用。在较低pH值下，瓜氨酸侧链脲基只与乙二醛发生反应。
结 语
功能性肽的深入研究与人类健康息息相关，其分离与富集技术的优化能够促进食品、药品等行业的快速发展，为实现这个目标需要借助其他领域的新材料、新方法，发展出便捷、高效、覆盖面广的分离和富集方法，才能更便捷、更高效地得到功能性肽，为国民健康奠定坚实的基础。
