辣椒（Capsicum annuum L.）作为一种常用的调味品，在世界广泛栽培。占其干果质量30%～60%的辣椒籽，在加工过程中却未被充分利用，造成资源浪费。我国辣椒种子蛋白的加工利用还有待开发。
实验室前期开展植物源抗菌肽筛选时，发现辣椒籽抗菌肽具有广谱抑制真菌的效果，尤其对谷类产品常见腐败菌黄曲霉具有强烈的抑制作用。西南大学动物科学学院的韩玉竹和杨叶梅*以及中国农业大学食品科学与营养工程学院、北京食品营养与人类健康高精尖创新中心的李平兰等人在此基础上优化了辣椒籽抗菌肽的提取条件，并结合超滤离心、葡聚糖凝胶层析等步骤，以期得到纯度较高的目标产物，为辣椒籽以及植物源抗菌肽的开发利用提供参考。
1 不同品种辣椒籽蛋白提取物对黄曲霉的抑菌活性
6 种辣椒籽品种（天鹰小椒、石竹花、新化、子弹头、印度椒和灯笼椒）的蛋白提取物均对黄曲霉生长具有抑制作用。不同品种辣椒籽的抑菌活性有差异，其中贵州灯笼椒和印度椒所含抗菌肽的抑菌效果显着高于其他4 个品种。结合辣椒籽的获取及经济成本，选择灯笼椒辣椒籽作为研究材料，进行后续研究。
2 抗菌肽提取条件的优化
2.1 缓冲液的选择对抗菌肽提取的影响
如图1所示，几种浸提液浸提后获得的抗菌肽均对黄曲霉生长具有抑制作用。其中EDTA缓冲液浸提后的抑菌圈直径显着大于其他几组（P＜0.05），因此后续试验选用EDTA缓冲液进行。
2.2 料液比对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响
结果显示，当料液比为1∶5（g/mL）时，提取物的抑菌圈直径显着大于其他几组（P＜0.05），效果最好，因此，后期响应面优化试验选用1∶5（g/mL）料液比作为中心试验点。
2.3 浸提时间对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响
结果显示，随着浸提时间的延长，抗菌产物的得率增加，当浸提时间为16 h时，提取率最大，当浸提时间大于16 h，抑菌圈直径略有减小，但差异不显着（P＞0.05）。因此，确定抗菌肽最适浸提时间应控制在16 h左右，并选择其为下一步响应面试验的中心试验点。
2.4 硫酸铵饱和度对辣椒籽抗菌肽抑菌活性的影响
结果显示，随着硫酸铵饱和度的升高，其沉淀所得物对黄曲霉菌的抑菌圈直径越大，但当硫酸铵饱和度达到80%时，沉淀出的抑菌产物与90%饱和度硫酸铵的抑菌效果无显着差异（P＞0.05），综合考虑得率和硫酸铵用量，选择80%饱和度的硫酸铵为后续响应面试验的中心试验点。
3 辣椒籽抗菌肽提取条件的响应面优化
3.1 回归模型的建立
根据响应面试验设计和结果，使用Design Expert 8.0.6软件对数据进行多元回归拟合，获得辣椒籽抗菌肽的抑菌圈直径（Y）对料液比（A）、浸提时间（B）、硫酸铵饱和度（C）的多项回归方程：
3.2 回归模型方差分析
将以上回归模型进行方差分析，结果显示，模型回归极显着（P=0.001 0），失拟检验不显着（P=0.428 79），说明未知因素对试验结果干扰较小。另外，模型的决定系数R2为0.949 3，表明方程与实际的测试数据吻合良好，较好反映了抗菌肽抑菌圈直径与料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度的关系，
因此，该模型可用于分析和预测辣椒籽抗菌肽的提取条件。通过F检验确定回归方程中每个变量对响应值影响的显着性，模型一次项A、B、C不显着；二次项A2、B2、C2均处于极显着水平；交互项AB、AC、BC均不显着。
3.3 响应面分析
根据回归方程制作的响应面立体分析图和等高线图如图5所示，分别反映了3 个因素（料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度）两两交互作用对响应值的影响。从方程可以看出，二次项的系数都是负数，以它为特征的抛物面开口方下，具有极大值点。通过Design Expert 8.0.6.1软件分析，辣椒籽抗菌肽最佳提取条件为料液比1∶5.05（g/mL）、浸提时间16.13 h、硫酸铵饱和度81.15%，在此条件下抗菌肽的抑菌圈直径为23.77 mm。
3.4 回归模型的验证
为进一步验证预测值，将优化确定的提取条件进行验证，重复6 次，结果显示抗菌肽的抑菌圈直径平均值为23.89 mm，与预测值拟合率为99.49%，表明预测值和实际值吻合良好，优化模型可靠。优化后抗菌肽活性比优化前（12.34 mm）提高了93.60%，表明本实验所确定的优化方案的设计合理有效，获得的提取条件可以显着提高抗菌肽的得率。
4 抗菌肽的分离纯化
4.1 抗菌肽脱盐及粗分离
将辣椒籽抗菌肽用透析袋脱盐处理后，再使用10 kDa的超滤管超滤离心，使辣椒籽抗菌肽达到粗分离目的，分别检测小于10 kDa组分和大于10 kDa组分的抑菌效果，选择具有良好抑菌效果的组分（＜10 kDa）进行下一步分离纯化。
4.2 葡聚糖凝胶柱层析
将10 kDa超滤管超滤后抑菌效果好的组分用葡聚糖凝胶G-50柱层析，以实现分离纯化的目的。通过上样量5 mL；流速20 r/min；洗脱时间250 min，在波长280 nm测定吸光度。分别回集3 组分峰，以黄曲霉为指示菌，分别检测各组分的抑菌活性。结果显示组分3的抑菌效果最好，确定组分3为目标样品。因组分2和组分3的峰有少部分重叠，为保障目标样品的纯度，通过不回集与组分2重叠的回集管，并对目标抗菌肽样品进行二次柱层析纯化，冷冻干燥后进行后续分子特性检测。
4.3 目标样品的分子质量测定
将葡聚糖凝胶柱-G50柱层析分离得到目标样品使用Tricine-SDS-PAGE检测其纯度和分子质量大小。如图7所示，抗菌肽只有一条清晰条带，说明纯化效果较好，通过和超低分子质量蛋白质Marker对比可估计其分子大小在7.8 kDa左右。
讨 论
由于原料理化特性差异，提取工艺也不同。目前还鲜有辣椒籽抗菌肽提取工艺的报道。因此，本研究依据前人的工作基础，考察不同浸提液、料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度对辣椒籽抗菌肽提取的影响。首先应用单因素试验，初步评价各因素对辣椒籽抗菌肽的提取效果，然后进一步在单因素试验基础上，通过响应面法对主要影响因素（料液比、浸提时间、硫酸铵饱和度）进行优化和评价，建立辣椒籽抗菌肽提取条件的二次多项式回归模型，并利用统计学方法对该模型进行显着性检验。通过对该模型进行求导和解矩阵可知，脱脂辣椒籽粉按料液比1∶5.05（g/mL）加入到EDTA缓冲液中浸提16.13 h后取上清液，添加81.15%饱和度的硫酸铵可以获得较大的得率，预测值为23.77 mm。在此条件下再进行验证实验，得到抗菌物质抑菌抑菌圈直径23.89 mm/150 μL，与预测值拟合率达99.49%，比优化前（12.34 mm）提高了93.60%。说明本研究所确定的优化方案的设计合理有效，获得的提取条件能够明显提高抗菌肽产量。
本研究通过10 kDa超滤粗分离后，选择抑菌效果好的组分过葡聚糖凝胶G-50柱层析，纯化后的抗菌肽经Tricine-SDSPAGE检测已达到电泳纯，分子质量在7.8 kDa左右，说明辣椒籽蛋白提取物的主要抑菌成分为抗菌肽。研究结果可为后续辣椒籽抗菌肽基本特性研究及抗菌肽的产业化应用提供参考依据。
