黑龙江八一农垦大学 国家杂粮工程技术研究中心的刁静静和黑龙江八一农垦大学食品学院的迟治平 、刘妍兵等人前期研究发现绿豆肽具有免疫活性，为了得到具有较高活性的绿豆免疫肽，本实验以绿豆肽为原料，采用葡聚糖凝胶G-15进行层析分离，将不同级分绿豆肽分别作用于RAW264.7细胞，分析不同细胞处理组的吞噬能力、核酸、糖原、细胞因子等免疫活性指标，筛选出具有较高活性的免疫肽级分，并对其进行结构分析，以期为进一步阐明绿豆肽的免疫调节作用机制提供技术支撑，也为绿豆肽在食品保健及医药领域的应用提供理论依据。
1、SephadexG-15层析分离绿豆肽
绿豆肽被分成4 个级分MBPH-1、MBPH-2、MBPH-3和MBPH-4，根据葡聚糖凝胶分离性质可知不同级分绿豆肽的分子质量由大到小为MBPH-1＞MBPH-2＞MBPH-3＞MBPH-4。采用Collection Microsoft软件对峰面积进行计算，结果如下：MBPH-1（2 400.58）、MBPH-2（2 294.41）、MBPH-3（1 165.28）、MBPH-4（420.00），其中MBPH-4级分绿豆肽量较少，不足以进行后续分析，遂与MBPH-3级分绿豆肽合并，统一归为MBPH-3级分。
2、不同级分绿豆肽对RAW264.7细胞增殖率的影响
由实验结果可知，不同处理组绿豆肽均对巨噬细胞增殖有促进效果，且呈梯度增加，巨噬细胞增殖率由低到高依次是未分级绿豆肽＜MBPH-1＜MBPH-2＜MBPH-3，其中MBPH-3级分促进效果最佳，MBPH-3组的增殖率为9.050%，相比MBPH-2、MBPH-1、未分级绿豆肽组分别增高6.77%、7.75%、8.42%。
3、不同级分绿豆肽对RAW264.7巨噬细胞糖原的影响
LPS刺激组和不同级分绿豆肽组细胞内紫红色结块偏多，染色程度加深，此时细胞内糖原含量升高，空白组细胞内颗粒分散稀疏。不同级分绿豆肽组糖原含量相比空白组差异显着（P＜0.05），其中MBPH-3级分促进效果最佳。
4、不同级分绿豆肽对RAW264.7巨噬细胞核酸的影响
LPS刺激组与不同级分绿豆肽组细胞体积变大、突触长而粗，核内的DNA呈黄绿色，基质内的RNA呈红绿色，相比空白组荧光强度明显增强，其中MBPH-3级分绿豆肽促进效果最佳。有研究表明核酸代谢活性的增强有利于激活巨噬细胞各种生命活动。综上所述，不同级分绿豆肽可促进核酸的代谢，提高巨噬细胞的活性，从而调节免疫功能，结果显示MBPH-3级分促进效果更为明显。
5、不同级分绿豆肽对小鼠巨噬细胞细胞因子的影响
不同级分绿豆肽刺激组TNF-α的分泌量趋势与IL-6、IL-1β相似，且MBPH-3组的细胞因子分泌量高于其他级分绿豆肽组，但低于LPS刺激组细胞因子分泌量，MBPH-1、MBPH-2、MBPH-3组TNF-α分泌量分别为565.16、537.63、828.13 pg/mL，均高于空白组（436.18 pg/mL），显着低于LPS刺激组。综上分析，不同级分绿豆肽可以通过促进促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，从而在促炎途径中发挥免疫调节作用。
6、不同级分绿豆肽对LPS刺激巨噬细胞细胞因子的影响
LPS刺激组的IL-6、IL-1β、TNF-α分泌量显着高于不同级分绿豆肽处理组以及空白组，而不同级分绿豆肽对LPS刺激的巨噬细胞细胞因子分泌水平有一定的抑制效果，且MBPH-3处理组抑制能力最佳，其TNF-α、IL-1β和IL-6分泌量分别为2 152.94、1 058.81、859.96 pg/mL，相比LPS刺激组（2 923.19、3 707.09、2 880.74 pg/mL）有一定抑制作用。
7、高免疫活性绿豆肽结构鉴定结果
根据b离子片段和y离子片段可推算出C端、N端氨基酸分子质量分别为132、132、181、75 Da和115、119、149 Da，通过氨基酸分子质量推测氨基酸序列为Asn-Asn-Tyr-Gly-Pro-Thr-Met，其分子质量为903 Da。
讨 论
绿豆肽具有免疫调节能力，免疫活性与其肽级分呈一定的相关性，分子质量为903 Da的肽链免疫活性较高，该级分能增强巨噬细胞增殖能力、促进核酸合成以及糖酵解的进行，可激活正常巨噬细胞的细胞因子IL-6、L-1β和TNF-α的表达，又能抑制LPS诱导产生IL-6、L-1β和TNF-α等细胞因子。其中，具有较高免疫活性的MBPH-3级分中主要氨基酸序列为Asn-Asn-Tyr-Gly-Pro-Thr-Met。
