Ca2+-藻酸盐微胶囊的多孔性会导致消化液或氧渗入微胶囊内部，从而造成益生菌的活性损失。壳聚糖作为一种无毒无害的阳离子材料通常用于涂覆藻酸盐微胶囊，为益生菌提供更好的保护。除用阳离子材料涂覆于微胶囊表面，将益生元添加于微胶囊的藻酸盐壁材中也被认为是改善产品中益生菌细胞活力的有效方法。藻酸盐寡糖（AOS）被认为是一种可用作益生菌和益生元共包封微胶囊的优质益生元。
为探究海洋寡糖微胶囊对益生菌的保护作用，以及在实际应用中的价值，中国海洋大学食品科学与工程学院的常柳依、庄晶云和江晓路*以及中国海洋大学医药学院的沈照鹏*等人制备包埋长双歧杆菌CICC6259的基础微胶囊。将基础微胶囊外包COS，或添加AOS且外包COS分别制备两种海洋寡糖长双歧杆菌微胶囊：COS-微胶囊和AOS-COS-微胶囊。通过体外和体内实验研究这些海洋寡糖益生菌微胶囊对长双歧杆菌的保护作用，并通过体内实验研究其对小鼠肠道菌群的调节作用，以期为新型益生菌微胶囊的研发和体内体外评估提供参考与指导。
1. 微胶囊包埋的活菌数及包埋率
结果显示，3 种长双歧杆菌微胶囊的包埋率在67%～72%之间，包埋活菌数在9.2～9.8（lg（CFU/g））之间。3 种微胶囊包埋的活菌数及包埋率的差异不显着（P＞0.05）。说明COS包衣或AOS益生元的添加不会对包埋率或包埋活菌数造成显着影响。
2. 模拟胃液处理对长双歧杆菌CICC6259活性的影响
结果显示，在所有样品中，长双歧杆菌活菌数在体外模拟胃液处理的120 min期间连续降低。模拟胃液处理120 min后，COS-微胶囊中的长双歧杆菌的减少量比没有涂层的基础微胶囊低约1 个数量级；AOS-COS-微胶囊中长双歧杆菌的减少量比基础微胶囊中的低约3 个数量级。说明添加AOS作为益生元可以增强微胶囊对益生菌的保护作用。AOS-COS-微胶囊在120 min的模拟胃液处理后，活菌数仍能达到106 CFU/g以上，具有良好的耐胃酸效果。
3. 长双歧杆菌CICC6259在模拟消化道体系中的活菌数及微胶囊的崩解状况
结果显示，活菌数量在模拟消化道体系中降低的原因可能是由于氢离子（0～1.5 h）和胆盐（1.5～5.5 h）的影响。在5.5 h的模拟消化液处理后，COS-微胶囊与AOS-COS-微胶囊中的活菌数均能达到106 CFU/g以上，且AOS-COS-微胶囊中的活菌数比基础微胶囊高1 000多倍，说明AOS-COS-微胶囊在模拟消化道体系中对长双歧杆菌具有最佳的保护作用。
微胶囊完全崩解所需的时间及形态变化如图4所示。相比较基础微胶囊，添加COS包衣可显着延长崩解时间约1.4 h（P＜0.05），COS-微胶囊与AOS-COS-微胶囊的崩解时间和形态变化较为相似。所有微胶囊均在小肠模拟液处理期间完全崩解。基础微胶囊在食管到胃的模拟液处理后（1.5 h）边缘较模糊，在十二指肠模拟液处理后（3 h）已部分崩解，不能保持完整的球状。而具有COS包衣的微胶囊在食管到胃及十二指肠模拟液处理后均能保持边缘及形状完整。
制剂在人体小肠内的平均转运时间为3～4 h，基于上述崩解情况可以推测，COS-微胶囊和AOS-COS-微胶囊是较为有效的长双歧杆菌运载体。它们不仅能将包埋的益生菌完全释放于肠道，还能在通过消化道期间对益生菌起到保护作用。
4. 长双歧杆菌CICC6259的贮藏稳定性分析
在4 ℃条件下贮藏一段时间后，微胶囊中的活菌数结果显示，COS的包衣和AOS的添加显着提高了长双歧杆菌的存活率（P＜0.05）。COS包衣可以为微胶囊提供致密的外层半透膜，从而加强微胶囊对氧的隔绝作用，在贮藏期内保持更高的活菌数。方微胶囊中加入AOS益生元能够在贮藏期内提供给长双歧杆菌额外的保护。
5. COS涂层的益生元效应验证
用对双歧杆菌无害的解囊液液化微胶囊，计数液化液中的活菌，发现基础微胶囊与3 种COS-微胶囊中的双歧杆菌数基本相同。因此，不同的COS含量是各种微胶囊液化液的唯一区别。将液化液全部接种到MRS肉汤中，3 种不同质量浓度COS包衣的COS-微胶囊中长双歧杆菌的生长曲线显示，5 mg/mL COS-微胶囊中释放的长双歧杆菌在对数生长期具有最高的生长速率，是基础微胶囊中的约1.71 倍；且在生长平台期具有最高的浓度，相比较基础微胶囊提高了25%。这证明了作为包衣材料的COS在解囊后可以刺激长双歧杆菌的生长，同时发挥了益生元作用。
综合上述所有体外实验，证明了益生菌微胶囊的COS涂层具有作为包衣和益生元的两种性质。此外，添加AOS能加强微胶囊在模拟胃液处理和贮藏时对益生菌的保护作用。同时有必要在体外实验的基础上进行动物实验，动物实验可以进一步测试海洋寡糖微胶囊的有益效果，并验证其作为一种功能性食品的实际应用价值。
6. 动物实验分析
6.1 微胶囊在体内的消化情况
模拟消化道体系实验证明，本研究中的所有微胶囊都可在小肠模拟液中解囊。体内消化实验表明，灌胃5 min后，3 种微胶囊在小鼠胃中均保持形态完好；灌胃1 h或3 h后，小鼠胃中尚有部分完整的微胶囊存在，在小肠中检出微胶囊碎片；灌胃5 h或7 h后，于小鼠胃和小肠中均未检出完整的微胶囊或微胶囊碎片；在灌胃后的任一时间段，盲肠和结肠中始终未检出完整的微胶囊或微胶囊碎片。证明了本研究中所有的微胶囊都能在小鼠小肠中完全解囊。
6.2 小鼠的肠道菌群分析
对各组小鼠肠道中的长双歧杆菌分别计数，结果显示，阳性对照组小鼠肠道中的长双歧杆菌含量是空白对照组的1.44 倍。相比较阳性对照组，基础微胶囊实验组（不含益生元）小鼠肠道中的长双歧杆菌含量显着提高（P＜0.05），这说明基础微胶囊在小鼠体内可为长双歧杆菌提供一定的保护，从而增加了小鼠肠道中长双歧杆菌的含量。COS-微胶囊实验组和AOS-COS-微胶囊实验组小鼠肠道中长双歧杆菌的含量与空白对照组和基础微胶囊实验组相比变化均显着（P＜0.05）。推测这与海洋寡糖微胶囊对益生菌的进一步保护作用以及海洋寡糖的益生元作用有关。
结果显示，阳性对照组和基础微胶囊实验组小鼠肠道菌群均出现OTU数量和α多样性显着上升的现象，而COS-微胶囊实验组和AOS-COS-微胶囊实验组与空白对照组无显着差异。
优势门的相对丰度如图8所示。所有组的主要门都是拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）和变形菌门（Proteobacteria），它们的总和占样品中微生物总量的97%～99%。组间比较，空白对照组小鼠肠道菌群中拟杆菌门和变形菌门的含量最高，厚壁菌门的含量最低。AOS-COS-微胶囊实验组小鼠肠道中厚壁菌门的含量最高，相比较空白对照组增加了25%；同时拟杆菌门和变形菌门的含量最低，相比较空白对照组分别降低了13%和8%。肠道中的厚壁菌门主要包括芽孢杆菌纲和梭菌纲。芽孢杆菌纲中包括芽孢杆菌目和乳杆菌目。
为更清晰地研究小鼠肠道中有益菌和有害菌的变化趋势，对优势属进行深入分析。如图9所示，阳性对照组和3 个实验组小鼠肠道中脱硫弧菌属（Desulfovibrio）、另枝菌属（Alistipes）、螺杆菌属（Helicobacter）、肠球菌属（Enterococcus）显着降低，罗斯氏菌属（Roseburia）、乳杆菌属（Lactobacillus）显着升高。且就变化幅度的大小排序，实验组＞阳性对照组＞空白对照组。双歧杆菌属（Bifidobacterium）虽在阳性对照组与3 种微胶囊实验组的小鼠肠道菌群中显着升高（相比较空白对照组），但在阳性对照组与3 种微胶囊实验组之间并未表现出明显差异。这与上述双歧杆菌计数实验结果不符，推测原因是双歧杆菌属在肠道菌群中占比太小，用相对丰度不能清晰地表示出小鼠肠道菌群中双歧杆菌含量的变化趋势。
综上所述，对小鼠肠道菌群的改善效果由高到低的益生菌制剂依次是AOS-COS-微胶囊、COS-微胶囊、基础微胶囊、裸双歧杆菌。包括AOS-COS-微胶囊和COS-微胶囊在内的海洋寡糖微胶囊具有最佳的改善肠道菌群的效果。
结 论
本实验以长双歧杆菌为例，证明了海洋寡糖微胶囊作为一种益生菌制剂，可以显着增强对益生菌的保护作用。由于较多的活性益生菌到达肠靶位点及益生元的释放，海洋寡糖微胶囊的摄入可以对肠道菌群起到良好的调节作用。通过增加益生菌（双歧杆菌、乳杆菌等）并减少条件致病菌（脱硫弧菌、螺杆菌、肠球菌等）的含量，降低机体罹患如肠道息肉、消化性溃疡、慢性胃炎、十二指肠炎等胃肠道疾病的风险。未来海洋寡糖微胶囊还可以被用于包埋其他种属的益生菌，具有良好的应用前景。
