东北传统发酵食品黏面子、辣酱、辣白菜等作为我国东北地区常见的食物同时也是乳酸菌的良好来源，近年来对于这些食品菌种资源与功能的研究甚少。吉林农业大学食品科学与工程学院的任大勇、曲天铭和杨柳等人通过实验旨在分离出具有高效降解胆固醇能力的乳酸菌，并综合分析其存在的主要降解机制，为特定功能益生菌的开发与利用提供一定的参考依据。
1. 降胆固醇菌株的体外筛选
前期从发酵食品中分离出120株乳酸菌，经过16s rRNA鉴定，这些菌株主要分为乳杆菌、明串珠菌和链球菌。其中植物乳杆菌82 株，肠膜明串珠菌亚种8株，清酒乳杆菌5 株，副干酪乳杆菌7株，还有乳酸链球菌、德氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌和嗜酸乳杆菌等。结果显示，胆固醇的清除率大于40%的菌株（共57 株，均为植物乳杆菌），其中6 株菌（C1、C2、H6、H9、L22、L30）的清除率高于85%。因此选取这6 株菌进行下一步降解机制的研究，并选取实验中降解能力最低的菌株T19（清除率为20.7%）作为阴性对照菌株。
2. 胆固醇与解离胆汁盐共沉淀
结果显示，在不同的植物乳杆菌环境中，胆固醇与甘氨胆酸钠和牛磺胆酸钠的解离产生胆酸的共沉淀作用。所有菌株均显示出了对这两种胆酸盐及其混合物不同程度的胆固醇共沉淀作用。菌株C2可使胆固醇与甘氨胆酸钠解离的胆酸产生最高的共沉淀（5.53±0.20）μg/mL，同时C2也在混合胆汁盐存在的条件下具有最高的胆固醇沉淀能力。但几乎所有菌株沉淀（除了H9）牛磺胆酸的能力都较低。对照菌株T19沉淀胆酸的能力显着低于其他菌株（P＜0.05）。
3. BSH活性测定结果
如图2所示，在加入胆汁盐的培养基中明显观察到了滤纸片周围产生了白色不透明的沉淀，表明7 株植物乳杆菌均具有BSH活性。根据产生沉淀圈的大小可粗略的估测出菌株H6具有较高的BSH活性，而阴性对照菌株T19表现出了最小的沉淀圈，说明菌株T19的BSH活性最低。
7 株植物乳杆菌细胞提取物的BSH活性显示，所有菌株在牛磺胆酸钠、甘氨胆酸钠以及混合胆汁盐存在的条件下均显示出了不同程度的BSH活性（0.31～1.73 U/mg）。与牛磺胆酸钠相比，所有的菌株（除了H9）均显示出了对甘氨胆酸钠更高的底物特异性。在甘氨胆酸钠以及混合胆汁盐为底物的条件下，菌株H6均具有最高的BSH活性，这与平板法粗测BSH活性实验结果相符。阴性对照菌株T19的BSH活性显着低于其他6株菌（P＜0.05），与2节共沉淀效应结果一致，因此推断菌株间BSH活性的差异可能是造成其胆固醇降解率差异的主要原因之一。
4. 4种bsh基因PCR检测结果
使用bsh基因引物通过PCR方法从7 株植物乳杆菌DNA中扩增了4 种基因，命名为bsh1、bsh2、bsh3、bsh4。基因测序及同源性分析表明，4种基因均属于植物乳杆菌BSH基因。其中bsh1基因长度为1 048 bp，bsh2基因长度为1000 bp，bsh3基因长度为956 bp，bsh4基因长度为918 bp。说明包括对照菌株T19在内的7 株植物乳杆菌均存在BSH基因。
5. BSH基因的相对表达量
qPCR结果显示，所有菌株的bsh1基因相对表达量最高（P＜0.05），其次是bsh3和bsh2，而bsh4最低。因此，受试菌株的BSH活性可能受bsh1基因表达的影响更大。菌株H6、L22、C2的bsh1表达量高于C1、H9、L30。菌株H6具有最高的表达量4.25×10-3，对照菌株T19表达量最低（1.53×10-3）（P＜0.05），这可能是导致T19菌株BSH活性低的主要原因。
6. 超声处理对胆固醇环境中乳酸菌存活率的影响
结果显示，超声处理对乳酸菌存活率的影响与其生长环境中是否存在胆固醇密切相关。在不含胆固醇的MRS培养基中，7 个菌株的存活率为0.68%～1.52%。在含有胆固醇的MRS培养基中，存活率上升到1.45%～2.65%。在同时含有胆固醇和胆盐的MRS培养基中，存活率进一步提高至5.6%～21.18%。
7. 热处理对乳酸菌去除胆固醇能力的影响
结果显示，静息状态下的6株乳酸菌对胆固醇的清除率为18%～45%，热处理后的菌体仍然具有10%～22%清除率。这说明即使在乳酸菌菌体细胞被破坏的情况下，仍然可以通过破碎的细胞膜吸附环境中的胆固醇。阴性对照组菌株T19与受试的其他6 个菌株情况类似，说明虽然细胞膜起到一定的吸附作用，但这并不是影响这些菌株降解效率的主要因素。
8. 乳酸菌抑制胆固醇胶束的形成
乳酸菌在模拟肠道环境条件下抑制胆固醇胶束形成的结果见图6。与空白对照组相比，加入乳酸菌干预后的胶束溶液，其透光率显着下降（从73.70%降低到60.51%～66.51%）（P＜0.05），说明乳酸菌破坏了胆固醇胶束的形成。
讨 论
本实验从黏面子、辣白菜、辣酱中分离出的乳酸菌品种丰富，其中主要有乳杆菌属、明串珠菌属、链球菌属等。本研究从体外评估了分离自上述食物中的乳酸菌的清除胆固醇的能力，其中有57 株菌株具有40%以上的清除率，这些菌株均为植物乳杆菌。期中，菌株C2、H6、L22具有较高的胆固醇清除能力，其清除率均在90%以上，明显高于之前的文献报道（30%～75%）。由于菌株T19的清除率较低（20.7%），故在本研究中将其作为阴性对照菌株阐明优良菌株的降解机制。
本研究结果表明，具有高降解率的菌株会产生高的共沉淀效应，沉淀的胆固醇约占总胆固醇的5.50%左右，且菌株在甘氨胆酸钠存在的条件下降解作用更高。在混合胆汁盐的条件下降解效率低于甘氨胆酸钠条件。实验结果表明胆固醇的共沉淀低于总清除率的5%，并且最终pH值在3.99～4.31之间，即使将pH值控制在2.0左右的时候，共沉淀效应仍没有明显的加强（结果未显示）。这说明共沉淀不是人体去除胆固醇的主要方式。BSH活性与产生共沉淀效应以及总胆固醇的清除率均有相关性。本研究中，菌株H6在甘氨胆酸钠为底物时具有最高的BSH活性（3.27±0.43）U/mL。阴性对照组菌株T19在体外胆固醇清除率、BSH活性以及共沉淀方面均显着低于受试的6 株菌株（P＜0.05），这说明并非所有乳酸菌均具有良好的胆固醇降解能力，降胆固醇能力即使在同一种属内也具有明显的菌株特异性。本研究结果表明，bsh1基因的表达最为活跃，推测其在植物乳杆菌BSH合成过程中起到主要作用。
为了进一步探究乳酸菌细胞膜对胆固醇是否有吸附作用，本研究采用超声裂解和热裂解两种方式评价了细胞膜裂解产物对胆固醇的吸附作用。结果表明，裂解后的细胞碎片对胆固醇仍有吸附作用，但这种吸附作用低于完整细胞状态。本研究最后采用模拟人的肠道环境进行了胆固醇胶束的配制，结果表明在乳酸菌存在的情况下，胶束的形成受到了抑制。抑制胆固醇胶束的形成就可以起到降低胆固醇在肠道内的吸收。虽然植物乳杆菌可以通过多种机制清除胆固醇，但其BSH活性是影响清除固醇能力的主要因素。
结 论
从东北传统发酵食品中分离的植物乳杆菌H6具有最高的清除胆固醇能力，并且降解机制主要通过胆固醇与细胞膜的结合、胆固醇胶束的破坏、胆汁盐的解离以及BSH活性清除胆固醇，且BSH为主要因素。菌株H6可以作为降低人体胆固醇的潜在后选菌株。后续还需要进行动物实验进一步确定H6的体内降胆固醇特性。
