能够耐受肠道内环境并在肠道定植的优良双歧杆菌对于应用具有重要现实意义。在众多益生作用中，免疫调节功能及机理一直备受关注，作为天然存在于结肠的优势菌群，双歧杆菌的种类和数量变化直接或间接影响机体的免疫功能。
东北农业大学乳品科学教育部重点实验室的万峰、孙思睿和孟祥晨*等人以从3～6 个月健康婴儿粪便自行分离鉴定的4 株动物双歧杆菌乳亚种作为实验菌株，比较其耐受性及黏附性能，并进一步分析具有优良抗性和黏附性能的双歧杆菌的免疫细胞调节活性。本实验旨在获得具有优良性能及潜在益生特性的双歧杆菌，为后续研究菌株的功能性成分及开发益生菌制品提供一定的参考依据。
一、4 株动物双歧杆菌的耐受性
1.1 耐酸及胆盐的能力
结果显示，在不同pH值条件下，4 株动物双歧杆菌存活率均差异显着（P＜0.05），随孵育时间的延长，活菌数逐渐下降。在pH 3条件下孵育3 h，除H27-9外，其余菌株存活率均在60%以上，其中H15-2（90.19%）的存活率显着高于其他3 株菌（P＜0.05）。当在酸性更强的pH 2环境中孵育1 h后，4 株菌的存活率均大于60%，而孵育3 h后，除对照株BB12（57.31%）外，实验菌株均检测不到活菌。在质量浓度为3 g/L胆盐溶液中孵育3 h后，菌株存活率均大于60%，菌株H15-2（94.84%）存活率显着高于其他受试菌株及对照株（P＜0.05）。
1.2 耐受模拟消化道环境的能力
为更好地模拟消化道环境，制备模拟口腔、胃液、肠液的消化液，如图1所示，菌体在经历模拟唾液5min、模拟胃液2 h、模拟肠液2 h的过程中，活菌数不断下降，最终存活率仍保持在90%以上，表现出对模拟消化道环境较好的耐受性，但均显着低于对照菌株BB12（P＜0.05）。受试的4 株菌中，H15-2（93.69%）的耐受性显着高于其他3 株菌（P＜0.05）。3 种模拟消化液中，模拟唾液对菌体存活影响较小，后两种消化液的影响更为显着。
二、4 株动物双歧杆菌的黏附力
2.1 对Caco-2细胞的黏附能力
双歧杆菌的黏附能力是衡量其能否定植于肠上皮细胞进而发挥益生作用的重要指标。结果表明，4 株双歧杆菌中，仅H34-21的黏附率（1.31%）显着低于其他3 株菌（P＜0.05），其余3 株菌的黏附率均大于或接近20%，与BB12（21.65%）无显着性差异（P＞0.05），表现出较好的黏附能力，其中H15-2的黏附率高达27.59%。
2.2 对致病菌黏附Caco-2细胞的影响
4 株受试菌对两株致病菌黏附Caco-2均有不同程度的抑制作用，除H27-9及H34-21外，其他菌株对沙门氏菌的黏附抑制作用强于大肠杆菌。在3 种作用方式中，排斥作用＞竞争作用＞替代作用。菌株BB12对两种致病菌的黏附抑制率显着高于4 株受试菌（P＜0.05）。在竞争和排斥实验中，H20-9、H27-9对两种致病菌显示出了明显的抑制效果；在替代实验中，H27-9、H15-2对沙门氏菌有较好的抑制作用。
三、4 株动物双歧杆菌产胞外多糖能力
结果显示，所有菌株均能合成胞外多糖且多糖产量均超过100 mg/L。4 株受试菌产胞外多糖能力均显着高于对照菌株BB12（P＜0.05），表现出较强的产胞外多糖能力，其中H15-2胞外多糖产量最高，达到121.87mg/L。
四、动物双歧杆菌H15-2对免疫细胞活性的影响
4.1 对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响
实验结果表明，脾淋巴细胞转化值随受试菌浓度增大而增加，表现出明显的剂量依赖关系。当菌数-细胞数比例为10∶1及100∶1时，菌株H15-2对淋巴细胞的转化值显着高于阳性对照组ConA（P＜0.05），表明H15-2可以调节脾淋巴细胞活性且在菌数大于107CFU/mL时效果更好。
结果发现只有当H15-2菌体浓度为108CFU/mL时，脾淋巴细胞的增殖指数大于1且显着高于阳性对照（P＜0.05），表明H15-2具有促进脾淋巴细胞增殖的作用。
4.2 对腹腔巨噬细胞能量代谢水平的影响
结果显示，腹腔巨噬细胞能量代谢水平与H15-2菌体浓度表现剂量依赖关系，当菌体与巨噬细胞的比例为10∶1及100∶1时，巨噬细胞能量代谢水平显着高于阳性对照组ConA（P＜0.05）。表明动物双歧杆菌H15-2可以调节巨噬细胞活性并促进其增殖，提高其能量代谢水平。
4.3 对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响
结果显示，当H15-2菌数-细胞数比例为10∶1及100∶1时，可以明显提高巨噬细胞的吞噬作用（P＜0.05），表明H15-2能够提高巨噬细胞活性，增强其吞噬功能，且吞噬能力与菌体数量呈剂量依赖关系。
讨论与结论
本实验的4 株动物双歧杆菌对酸有更好的耐受能力，经pH 3和pH 2条件下孵育1 h后，仍有超过80%和60%的存活率，这可能是由于不同菌种间的差异造成的。本研究的菌株在相同胆盐质量浓度下处理3 h后存活率均大于60%，其中H15-2的存活率高达94.84%。本实验的4 株动物双歧杆菌均具备较好的耐酸、耐胆盐能力。
本实验除考虑菌株对酸及胆盐的耐受性外，还通过体外连续模拟消化道环境评价其耐受性。本实验室自行设计的连续模拟消化道环境与这些实验类似，但本实验的4 株动物双歧杆菌在历经模拟消化道后仍有90%的存活率，且活菌数对数值下降不到1 个数量级，H15-2存活率高达96.7%，这表明本实验4 株动物双歧杆菌具有较强的抗消化道胁迫能力。由于条件限制，本方法未能模拟胃肠蠕动及pH值的动态变化，有一定缺陷和不足，但仍可作为前期筛选耐受性优良菌株的重要依据。本实验的双歧杆菌H15-2的黏附率高于商业菌株LGG和BB12，可达27%，具有较强的黏附性能。本实验采用了平板菌落计数法，评价的是存活菌体的黏附。由此可见，黏附模型不同，菌株生境来源以及种属不同，双歧杆菌的黏附能力存在较大差异。
本研究中的4 株动物双歧杆菌可以通过竞争、排除和替换方式抑制致病菌的黏附，从而起到保护宿主细胞的作用，菌株H20-9和H27-9对沙门氏菌和大肠杆菌黏附抑制率最高可分别达75.04%和66.5%。本研究胞外多糖合成相关结果与其他实验结果的相关性并不明显，且具体对耐受性及黏附性的贡献度尚未得知，需要更加深入研究其机制以证实三者间的联系。此外，有研究指出与消化道逆环境耐受能力高度相关的多糖为荚膜多糖，而本实验测得粗多糖为黏液多糖，因此仍需要进一步实验探究其相关性。本实验的4 株动物双歧杆菌胞外多糖平均产量在120 mg/L左右，显着高于对照株BB12。本实验仅限于体外研究，在体内具体的有效剂量仍需进一步探索研究。
综上所述，动物双歧杆菌H15-2具有良好的耐受性、黏附力及产胞外多糖能力，并且具有潜在的免疫调节作用，可作为具有益生功能的菌株进行深入研究和开发。
