随着高通量测序技术的不断进步，越来越多的科研人员利用该技术对复杂环境微生物进行分析。沈阳农业大学食品学院的安飞宇、武俊瑞和乌日娜*等人采用高通量测序技术分析了在发酵过程中传统自然发酵豆酱细菌菌群结构的变化，及其周围土壤环境和酱醅的细菌群落组成。揭示土壤环境对自然发酵豆酱细菌菌群结构影响，为提高豆酱风味及品质研究提供一定的理论参考。
1、稀释曲线
结果显示，当测序深度＜10 000时，多样性指数随着测序深度的增加而迅速增加；当测序深度在10 000～30 000之间时，多样性指数随着测序深度的增加而缓慢增加；测序深度＞30 000时，稀释度曲线趋于平台期，表明测序准确有效，可以充分反映样品的多样性。
2、样品复杂度分析
四平样品α多样性分析结果以及辽中样品α多样性分析结果显示，与酱醅和豆酱样品相比，土壤样品的物种最为丰富，菌群结构明显复杂。两家酱醅的群落丰富度比较相似，进入液态酱阶段后，物种丰度都有所上升，随着发酵的进行有所下降，随后丰度上下波动。特别是，两家豆酱的细菌丰度指数都在第4个发酵阶段（S4、L4）出现峰值，说明该阶段可能为传统自然发酵豆酱发酵最为活跃的时期。
通过Shannon指数对样品多样性的比较，发现两家酱醅中菌群的多样性指数均低于下酱当天的样品，可能的原因为：在下酱的过程中，酱缸周围土壤环境中的微生物扩散进入酱缸，从而影响了豆酱发酵初期的细菌多样性。同时，与下酱当天的样品相比，各发酵阶段豆酱的菌群多样性整体呈下降趋势。另外，所有土壤，酱醅及豆酱样品的Coverage值都接近于1，说明覆盖率较高，测序结果体现了样本中微生物的真实情况。
3、物种组成比较分析
3.1 物种Venn图分析
图2A为四平发酵前3 个阶段的豆酱与酱醅及土壤的Venn图，样品S1、S2、S3与土壤单独共有（排除与酱醅共有）的OTU数分别为27（36.49%）、15（26.79%）、7（16.67%）。到了发酵后3 个阶段，如图2B所示，单独共有OTU数减少为24（34.78%）、7（19.44%）、10（23.26%）。图3A为辽中豆酱发酵前3 个阶段与酱醅及土壤的Venn图，样品L1、L2、L3与土壤单独共有的OTU数分别为47（40.51%）、9（21.95%）、13（25%）。到了发酵后3 个阶段，如图3B所示，单独共有的OTU数减少为11（23.40%）、5（11.90%）、18（28.13%），变化趋势与四平样品结果相似。
结果表明，两家豆酱在发酵的第1个阶段（S1、T1），豆酱与土壤单独共有OTU数目及占比均达到峰值，说明此阶段土壤环境对发酵豆酱的OTU影响最大。随着发酵的进行，这种影响逐渐减弱并上下波动，且与多样性指数分析结果一致。可能的原因为：在发酵的第1个阶段，也就是下酱时期，土壤环境与豆酱直接接触的机会最多，存在较大规模的细菌相互扩散，从而对豆酱初期的菌群结构产生了一定影响。后期随着发酵的进行，菌群结构会趋于相对稳定，同时土壤环境与豆酱接触的机会减少，因此土壤环境对后期豆酱菌群结构影响较小。
3.2 门水平下样品菌群结构分析
四平样品在门水平上的群落组分如图4所示，土壤中微生物菌群结构最为复杂，其主要的细菌门包括：厚壁菌门（Firmicutes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）、绿弯菌门（Chloroflexi）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、酸杆菌门（Acidobacteria）、芽单胞菌门（Gemmatimonadetes）。发酵酱醅和豆酱的菌群结构在门水平上较为相似，其主要的细菌门包括：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门。发酵不同阶段的优势细菌门均为厚壁菌门（占总数86.72%～99.50%），同时在酱醅阶段及发酵前期，变形菌门（占总数10.84%～12.87%）也被大量检出。值得一提的是，在豆酱发酵的各个阶段均检测到一定数量的放线菌门（0.35%～12.87%），并在发酵前两个阶段最为丰富，且放线菌门并未在酱醅样品中大量发现。
辽中样品也出现了相似结果，如图5所示，辽中样品主要的细菌门包括：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门、绿弯菌门、酸杆菌门、芽单胞菌门、拟杆菌门，其中放线菌门的相对丰度低于四平样品。发酵酱醅和豆酱的菌群结构在门水平上也较为相似，其主要的细菌门包括：厚壁菌门、变形菌门、放线菌门。发酵不同阶段的优势细菌门均为厚壁菌门（占总数84.46%～99.86%），同时在发酵的首个阶段，变形菌门（14.10%）和放线菌门（1.40%）也被大量检出，但在酱醅样品中放线菌门并未大量出现。因此，推测土壤环境的确会对豆酱菌群结构产生一定影响，且主要的扩散菌门为放线菌门。但随着发酵的进行，这种影响会逐渐减弱，并维持在一定水平，该结果与之前的Venn图分析结果一致。另外由图4、5可知，辽中土壤对其豆酱的菌群结构影响较小，可能是由于辽中土壤样品中的放线菌门的相对丰度（23.90%）要低于四平样品（33.91%）导致。
3.3 属水平下样品菌群结构分析
进一步分析了属水平下各样品的菌群结构，动态跟踪了整个豆酱发酵过程中细菌变化过程。如图6所示，四平样品主要的细菌菌属为：芽孢杆菌属（Bacillus）、四联球菌属（Tetragenococcus）、明串珠菌属（Leuconostoc）、假单胞菌属（Pseudomonas）、乳杆菌属（Lactobaillus）、魏斯氏菌属（Weissella）、不动杆菌属（Acinetobacter）、考克氏菌属（Kocuria）等。
在酱醅阶段，优势菌属为：芽孢杆菌属（87.08%）和假单胞菌属（12.86%）。加入盐水后，进入豆酱阶段，其优势菌属为：芽孢杆菌属（12.56%～68.62%）、四联球菌属（0.0 4%～8 1.4 3%）、明串珠菌属（0.89%～10.40%）、魏斯氏菌属（0.09%～7.26%）、乳杆菌属（0.65%～5.94%）。酱块加入盐水后，前3 个阶段芽孢杆菌逐渐减少，由S1阶段的68.62%减少到S3的12.56%。原本在酱醅中大量存在的假单胞菌属在豆酱发酵阶段逐渐减少，在S3阶段仅占0.06%。四联球菌在S2阶段迅速增加，到S3阶段成为豆酱中占绝对优势的细菌。相较于发酵豆酱而言，土壤中的细菌菌属过于复杂，单从群落组分图上无法准确得知其对豆酱菌群的具体影响。因此运用Heatmap图进行深入分析，如图7所示，放线菌门中的考克氏菌属（0.28%～1.57%）仅在土壤及豆酱样品中（尤其是发酵前期）有较高丰度，而在酱醅样品中并未大量发现。
如图8所示，辽中样品主要的细菌菌属为四联球菌属、乳杆菌属、明串珠菌属、肠球菌属（Enterococcus）、假单胞菌属、不动杆菌属、魏斯氏菌属等。在酱醅阶段，优势菌属为乳杆菌属（88.16%），明串珠菌属（8.59%）。加入盐水后，进入豆酱阶段，其优势菌属为四联球菌属（0.29%～96.58%）、乳杆菌属（1.96%～51.85%）、肠球菌属（0.26%～12.63%）、明串珠菌属（0.5 5%～1 1.0 6%）、假单胞菌属（0.04%～7.90%）。两家豆酱中都存在乳杆菌属和明串珠菌属。此外，肠球菌属仅为辽中豆酱的优势菌属，而在四平豆酱中并未检出。
图9 为辽中样品Heatmap图，在丰度前20的菌属中并未找到土壤与豆酱有明显相关性的菌属，其原因可能为：1）下酱过程中操作手法的不同，使土壤环境与豆酱接触少；2）辽中土壤样品中的放线菌门的相对丰度较低，无法深入影响发酵豆酱菌群结构或是所影响的菌属丰度较低，无法在图中体现。该结果也与之前门水平的研究结果一致。两家豆酱细菌群落结构有较大差异，表明传统发酵豆酱中细菌菌群结构组成与原料、制作手法、地区差异均有密切联系，因此还需要进行后续实验和数据积累，并结合如转录组、代谢组等其他组学共同研究，以期进一步了解传统自然发酵豆酱风味和微生物组成差异的原因。
结 论
利用高通量测序技术，分别鉴定了采集自四平，辽中两家传统自然发酵的成熟酱醅、豆酱以及酱缸周围土壤环境的细菌群落结构。结果表明，四平样品酱醅阶段优势菌属及相对丰度为芽孢杆菌属（87.08%）和假单胞菌属（12.86%）。豆酱阶段优势菌属及相对丰度为芽孢杆菌属（12.56%～68.62%）、四联球菌属（0.0 4%～8 1.4 3%）、明串珠菌属（0.89%～10.40%）、魏斯氏菌属（0.09%～7.26%）、乳杆菌属（0.65%～5.94%）。辽中样品酱醅阶段优势菌属及相对丰度为乳杆菌属（88.16%），明串珠菌属（8.59%）。豆酱阶段优势菌属及相对丰度为四联球菌属（0.29%～96.58%）、乳杆菌属（1.96%～51.85%）、肠球菌属（0.2 6%～1 2.6 3%）、明串珠菌属（0.55%～11.06%）、假单胞菌属（0.04%～7.90%）。
在揭示自然发酵豆酱细菌菌群的动态变化的同时，比较分析土壤环境对自然发酵豆酱细菌菌群结构的影响，本研究发现：土壤环境会对豆酱菌群结构产生一定影响，且主要的扩散细菌为放线菌门中的考克氏菌属，但随着发酵的进行，这种影响会逐渐减弱，并维持在一定水平。
讨 论
高通量测序结果表明，两家豆酱细菌群落结构存在一定差异，其可能是除原料及酿造工艺外造成豆酱风味不同的另一主要原因。土壤环境对豆酱细菌菌群结构产生一定影响，但随着发酵的进行，豆酱菌群结构会趋于相对稳定，土壤环境与豆酱接触的机会减少，从而使得土壤环境对豆酱细菌菌群结构影响减小。同时，下酱过程中的操作手法，土壤样品中的放线菌门的相对丰度也可能对菌群结构变化造成影响。此外，土壤环境中的霉菌对豆酱菌群结构是否存在影响还有待探讨，同时还需结合如转录组、代谢组等其他组学共同研究，以期进一步了解传统自然发酵豆酱风味和微生物组成差异的原因及其代谢机理。
