GOS的商业化生产主要以乳清中的乳糖为原料，通过微生物酶法催化合成。β-半乳糖苷酶（EC 3.2.1.23），又称乳糖酶，常用于乳糖水解，可生成半乳糖和葡萄糖，某些微生物来源的β-半乳糖苷酶在水解乳糖分子的同时，还具有转半乳糖基的活性，能够以乳糖或葡萄糖分子作为半乳糖基受体合成GOS。双歧杆菌、乳杆菌等乳酸菌具有一般公认安全（GRAS）的优势，使得其所生产的β-半乳糖苷酶可不经精细纯化即可应用于GOS合成。因此，双歧杆菌、乳杆菌等乳酸菌来源的β-半乳糖苷酶更适合高益生指数GOS的合成。
基于以上研究背景，石河子大学食品学院王丽军、牟元珍和关波*从新疆伊犁地区少数民族传统奶酪样品中分离筛选产转糖基活性β-半乳糖苷酶的乳酸菌菌株，进一步对筛选菌株产β-半乳糖苷酶培养条件、以乳糖为底物合成GOS的反应条件及产物成分进行研究，以期为高益生指数GOS的合成提供新的食品级产酶菌株。
1. 产转糖基活性β-半乳糖苷酶菌株的筛选鉴定
1.1 转糖基活性β-半乳糖苷酶产生菌的筛选
分离纯化得到的可培养物在含有X-gal的MRS平板上划线分离，得到32 株菌落为蓝色的菌株，表明这32 株菌具有β-半乳糖苷酶活性。收集初筛菌株的菌体细胞，破碎得到粗酶液，以乳糖为底物进行转糖基反应进行复筛，产物采用TLC分析，结果如图1所示，获得具有转糖基活性的菌株6 株，其中菌株YLBGNL-S7的转糖基活性最强，因此对该菌株开展进一步的研究。
1.2 形态学及生理生化特征
形态学观察显示，菌株YLBGNL-S7在MRS培养基上形成圆形菌落，边缘整齐，表面光滑，呈乳白色；菌体杆状，革兰氏染色阳性。菌株YLBGNL-S7的生理生化特征结果显示，该菌株能发酵葡萄糖、乳糖，不能发酵阿拉伯糖、鼠李糖、木糖，且淀粉水解实验、明胶水解实验、硫化氢产生实验结果均为阴性。这些特征与乳酸杆菌的特征极为相似，初步断定该株菌为乳杆菌。
1.3 16S rRNA基因的克隆及其序列分析
对菌株YLBGNL-S7的16S rRNA基因序列进行扩增，获得大小约为1 500 bp的扩增片段（GenBank登录号为MH917109）。将扩增所得基因序列与GenBank数据库中的序列进行同源性比对，比对结果显示，菌株YLBGNL-S7的16S rRNA基因序列与多株L. plantarum的16S rRNA基因序列相似性均达到99%。系统进化分析（图2）显示YLBGNL-S7与L. plantarum JCM 13899（LC311069.1）、L. plantarum DJ-04（KF929420.1）、L. plantarumA16（MG754631.1）及L. plantarumNi344（AB601168.1）等菌株以100%的支持率聚成一簇。结合生理生化实验，将菌株YLBGNL-S7鉴定为L. plantarum YLBGNL-S7。
2. 产β-半乳糖苷酶条件的优化
2.1 碳源对产酶的影响
为确定L. plantarum YLBGNL-S7产酶的最佳碳源，分别以不同的碳源组合的发酵培养基，37 ℃摇床培养12 h，测定菌株的生物量OD600 nm及产β-半乳糖苷酶酶活，结果显示，不同碳源条件下菌株的生物量无明显差异，但以乳糖为单一碳源时YLBGNL-S7菌株产β-半乳糖苷酶的酶活最高，可达（84.5±2.9）U/mL，显着高于其他碳源（组合），表明该菌株所产β-半乳糖苷酶为诱导酶。
2.2 乳糖质量浓度对产酶的影响
进一步对不同乳糖质量浓度条件下YLBGNL-S7菌株产β-半乳糖苷酶的水平进行测定，结果表明，乳糖质量浓度为10 mg/mL时，最适合该菌株发酵产β-半乳糖苷酶。
2.3 菌株的产酶曲线与生长曲线
在以上单因素试验优化的基础上，将L. plantarum YLBGNL-S7菌株接种于改良的MRS培养基中，37 ℃摇床培养至24 h，产酶曲线显示该菌株在培养18 h左右时产酶水平最高，可达（157.1±7.9）U/mL。
3. β-半乳糖苷酶转糖基反应条件的研究
3.1 pH值对GOS合成的影响
分别以pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液配制乳糖溶液，55 ℃进行转糖基反应，TLC分析不同反应pH值条件的产物。结果表明，pH 6.0为转糖基反应的最适pH值。
3.2 初始乳糖质量浓度对GOS合成的影响
随着初始乳糖质量浓度的增加，转糖基反应产物中GOS的量逐渐增加，当初始乳糖质量浓度为300 mg/mL时，转糖基反应生成GOS的得率最高。
3.3 反应温度对GOS合成的影响
用pH 6.0的磷酸氢二钠-柠檬酸钠缓冲液配制300 mg/mL的乳糖溶液，分别在45、50、55、60 ℃进行转糖基反应，TLC分析其产物。结果显示转糖基反应的最适温度为50 ℃。
3.4 反应时间对GOS合成的影响
随着反应的进行，反应液中乳糖含量不断降低，反应4 h转糖基反应生成的GOS含量最高，继续反应，转糖基反应产物中的GOS含量逐渐降低，因此确定该β-半乳糖苷酶以乳糖为底物合成GOS的最佳反应时间为4 h。
4. 以乳糖为底物合成GOS产物组分的定量分析
基于TLC分析的实验结果，取pH 6.0，初始乳糖质量浓度为300 mg/mL，50 ℃条件下转糖基反应4 h的GOS产物进行HPLC分析。结果显示，其中保留时间为34.375 min的峰为半乳糖，保留时间为32.022 min为葡萄糖，26.740 min为二糖（乳糖和转移二糖未分离），22.522 min为低聚半乳三糖，6.758～19.485 min之间的峰为三糖以上的低聚半乳糖成分。
根据峰面积计算，最适反应条件下转糖基产物中葡萄糖质量分数为29.84%，半乳糖质量分数为15.28%，二糖（包括乳糖和转移二糖）质量分数为29.77%，转移三糖质量分数为12.95%，转移三糖以上的GOS质量分数为12.17%。结合TLC分析中乳糖与转移二糖斑点的扫描结果，确定乳糖质量分数为11.48%，转移二糖质量分数为18.29%。因此，可确定以L. plantarum YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶催化乳糖合成GOS的得率为43.40%，GOS成分以转移二糖和转移三糖为主，分别为18.29%和12.95%，残余乳糖质量分数仅为11.48%。
讨 论
本研究选择新疆伊犁地区少数民族传统奶酪样品进行分离筛选，并成功获得产转糖基活性较高的β-半乳糖苷酶乳酸菌6 株。对其中转糖基活性最高的YLBGNL-S7菌株进行生理生化和16S rRNA基因序列比对分析，确定该菌株为植物乳杆菌（L. plantarum）。对比不同来源L. plantarum产β-半乳糖苷酶水平可以发现，本研究分离筛选的乳源L. plantarumYLBGNL-S7和泡菜来源L. plantarum70810在乳糖为碳源的MRS培养基中产β-半乳糖苷酶水平相差约30 倍（（157.1±7.9）U/mL和5～6 U/mL），表明乳源L. plantarum产β-半乳糖苷酶及分解利用乳糖能力显着强于泡菜来源L. plantarum。
本研究中L. plantarumYLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶以乳糖为底物合成GOS的最适pH 6.0，表明其较为适合于牛乳和乳清中乳糖的水解。YLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶在初始乳糖质量浓度为100～400 mg/mL及45～60 ℃的温度范围内均可有效合成GOS，表明该β-半乳糖苷酶能够在较宽的乳糖质量浓度及温度范围内催化合成GOS。
本研究中从奶酪样品中筛选的L. plantarumYLBGNL-S7所产β-半乳糖苷酶在初始乳糖质量浓度为300 mg/mL、pH 6.0、50 ℃的条件下反应4 h，GOS的得率最高达到43.40%，高于人唾液来源L. plantarum WCFS1的41%，略低于泡菜来源L. plantarum 70810的44.3%，但高于商业化菌株B. circulans来源的β-半乳糖苷酶合成GOS的得率40%。与K. lactis来源β-半乳糖苷酶以乳糖为底物的转糖基反应产物主要为转移二糖不同，YLBGNL-S7合成GOS产物中转移二糖和转移三糖质量分数分别为18.29%和12.95%，残余乳糖质量分数仅为11.48%，与L. plantarum WCFS1来源β-半乳糖苷酶合成GOS中转移二糖质量分数为19%、转移三糖质量分数为21%、转移四糖质量分数1.3%，残余乳糖质量分数为15%较为接近。然而，不同来源L. plantarum所产β-半乳糖苷酶合成GOS的糖苷键类型是否存偏好性的差异，还有待进一步研究。
结 论
本研究从新疆伊犁地区少数民族传统奶酪中筛选获得的一株产转糖基活性β-半乳糖苷酶的新菌株，形态学、生理生化及分子生物学鉴定为L. plantarumYLBGNL-S7。该菌株在以乳糖为碳源的MRS培养基中发酵产β-半乳糖苷酶水平可达（157.1±7.9）U/mL，其所产β-半乳糖苷酶在50 ℃、pH 6.0、乳糖质量浓度300 mg/mL反应4 h，反应产物GOS得率可达43.40%，该菌株为酶法合成GOS提供了新的食品级酶源。
