近年来，L-天冬酰胺酶的应用研究多集中于II型酶，多种不同来源的L-天冬酰胺酶II型皆被证实了具有抑制高热加工食品中丙烯酰胺生成的能力，而有关I型酶的应用研究相对较少，有关于地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶I型的应用研究鲜见报道。
本实验室在前期研究中筛选到一株具有L-天冬酰胺酶活力的地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis Z-1，菌种保藏号：CGMCCNO:17310）。为了提高地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶的表达量，降低其纯化难度，南京农业大学食品科技学院的陈菊花、焦琳舒和吕凤霞*等人将地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶I型酶基因克隆，并实现了其在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达，进行了重组酶的酶学性质研究。同时，探究了其在油炸土豆中的丙烯酰胺降解能力，为I型酶在食品中的应用提供理论依据。
酶基因扩增和序列分析
以B.licheniformis Z-1基因组DNA为模板，扩增ansA基因如图1所示，目的条带长度在1 000 bp左右，测序结果显示该基因序列为972 bp，编码324 个氨基酸，证明B. licheniformis Z-1 L-天冬酰胺酶ansA基因已克隆成功，命名为BlAase I型。为了分析不同微生物来源的L-天冬酰胺酶的亲缘关系，将BlAase I型和目前已发表的5 种L-天冬酰胺酶I型绘制系统进化树（图2）。进化树显示BlAase I型与古菌Pyrococcus furiosus和Pyrococcus horikoshii来源的L-天冬酰胺酶I型在进化关系上更为相近。
重组L-天冬酰胺酶的表达与纯化
重组酶粗酶活为（63.64±3.18） IU/mL，通过Ni柱纯化后，重组酶比活力为945.79 IU/mg，纯化倍数为21.70 倍，回收率为71.4%。对重组酶进行SDSPAGE电泳验证，结果表明，目的蛋白在35 kDa左右有单一条带（图3），与理论值36.6 kDa相符合。
酶学性质研究
1 重组酶的最适反应pH值和pH值稳定性
将重组酶置于37 ℃、pH 6.0～11.0的条件下进行酶活力测定。结果显示，重组酶的最适反应pH 10.0。将重组酶在pH 6.0～11.0的缓冲液中4 ℃条件下储存12 h后，测定重组酶相对酶活力。其pH值稳定性结果如图4B所示，重组酶pH值稳定性较好，在pH 6.0～11.0范围内储存12 h仍保留60%以上的活性。此重组酶具有一个相对较宽的pH值活性范围，在碱性的环境中都表现出良好的催化活性。
2 重组酶的最适反应温度和温度稳定性
将重组酶置于pH 8.0，温度范围为25～60 ℃条件下进行酶活力测定。结果显示，重组酶最适反应温度为45 ℃。将重组酶置于不同温度下，每隔一段时间取样，在最适反应pH值及最适反应温度下测定酶活力。结果显示，该重组酶在低温（4 ℃）条件下保存稳定，12 h后相对酶活力仅下降3.79%。当在较高温度（40 ℃和45 ℃）处理12 h后，相对酶活力仍高于90%。当温度高于45 ℃时，酶的热稳定性显着降低，在50 ℃存放10 h后相对酶活下降至30.62%，在60 ℃存放8 h后相对酶活力仅为3.87%。
3 金属离子对重组酶活力的影响
研究终浓度为1 mmol/L的不同金属离子对重组酶活力的影响，结果显示，Mn2＋、Mg2＋和K＋对重组酶具有显着激活作用，Mn2＋的作用效果最强；而Zn2＋对重组L-天冬酰胺酶有抑制作用，使其相对酶活力降低至（82.95±1.23）%；其余各金属离子对酶活力无显着影响。
4 重组酶底物特异性与动力学研究
测定重组酶对不同底物的作用效果。结果显示，该重组酶能水解L-天冬酰胺和D-天冬酰胺，但对D-天冬酰胺的活性仅为L-天冬酰胺的23.38%，对L-谷氨酰胺等其他4 种底物均无活性。使用Lineweaver-Burk双倒数作图，计算重组酶对底物L-天冬酰胺的Km和Vmax，结果显示，米氏常数Km为12.19 mmol/L，最大反应速率Vmax为2.69 IU/mL。
重组酶处理对薯条中丙烯酰胺含量的影响
结果如图8所示，L-天冬酰胺作为丙烯酰胺的重要前体物质，随着酶浓度的增加，土豆条中的L-天冬酰胺转化为L-天冬氨酸的转化率逐渐增加，从而导致最终薯条中丙烯酰胺含量逐步降低。未经酶处理的土豆条中（对照组）丙烯酰胺含量为5.780 μg/g，将土豆条置于5 IU/mL和20 IU/mL的酶液中浸泡30 min后，丙烯酰胺含量分别降低31.96%和40.87%，置于30 IU/mL的酶液中浸泡30 min后，丙烯酰胺含量进一步降低，降幅达58.39%。随着重组酶添加浓度的升高，薯条中丙烯酰胺含量逐渐降低。
讨 论
本研究中将地衣芽孢杆菌L-天冬酰胺酶I型酶基因在大肠杆菌中表达，测定了重组酶酶学性质以及对油炸土豆中丙烯酰胺的抑制效果。将BlAase I型氨基酸序列与不同来源L-天冬酰胺酶I型进行同源性比对发现，BlAase I型与已知结构的其他I型酶差异较大。作为一种新型的L-天冬酰胺酶I型，BlAase I型具有出色的催化能力，重组酶活力可达（63.64±3.18）IU/mL，高于多种其他来源的L-天冬酰胺酶。酶学性质研究结果表明，BlAase I型的最适反应pH值为10.0，相较于大多数L-天冬酰胺酶偏碱性。在pH6.0～9.0范围内储存12 h后，BlAase I型仍保留80%以上的活性。此外，大部分的L-天冬酰胺酶来源于嗜温微生物，其最适反应温度在30～45 ℃之间，BlAase I型的最适反应温度为45 ℃，同样符合这一特点。BlAaseI型热稳定性较好，在45 ℃处理12 h后相对酶活力仍大于90%。这些特性使其可耐受食品加工过程中各种苛刻的pH值及稳定环境，在食品加工领域中具有广阔应用前景。另外，Mn2＋对重组酶具有较强的激活作用。在底物特异性方面，BlAase I型对L-天冬酰胺的特异性强，无谷氨酰胺酶活性，具有较弱的D-天冬酰胺催化活性。
BlAase I型可有效抑制薯条中丙烯酰胺的产生，在30 IU/mL的酶液中处理0.5 h后，丙烯酰胺降解率最高可达58.39%。与其他文献报道中的L-天冬酰胺酶II型相比，BlAase I型对油炸土豆中丙烯酰胺的降解效果仍有差距。针对BlAase I型底物亲和力不强的问题，基于该酶现有的生物学特性，分析可能影响底物结合的关键氨基酸位点，利用定点突变和迭代饱和突变技术对其进行分子改造，获得底物亲和力显着提高的突变酶，从而提高该酶的工业应用潜力。
