鉴于柚类种子和白色海绵层中柠檬苦素类似物和柚皮苷含量较高，西北农林科技大学葡萄酒学院的毕静莹、李华*和王华*选择‘高台’蜜柚这两部分进行柠檬苦素、诺米林和柚皮苷3 种苦味物质的提取、纯化和超高效液相色谱（UPLC）检测。通过预实验并结合文献报道，发现3 种苦味物质在50 μmol/L时对癌细胞均有显着的抑制作用，因此本研究均选用50 μmol/L浓度的这3 种苦味物质对宫颈癌HeLa细胞进行处理，利用细胞增殖检测（CCK-8）、细胞划痕和逆转录-聚合酶链式反应（RT-PCR）实验研究3种苦味物质对HeLa细 胞增殖、迁移和凋亡的影响，以验证其作用效应。
苦味物质的检测
根据3 种苦味物质的线性范围及回归方程。由标准曲线方程可知，柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的线性关系决定系数范围在0.996 4～0.999 7，说明在质量浓度范围内线性关系良好。本实验柠檬苦素类似物的提取率为5.21 mg/g。柠檬苦素和诺米林的纯度分别为94.08%和93.91%；柚皮苷的提取率为7.72 mg/g，纯度为93.39%。
3 种苦味物质抑癌活性研究
3 种苦味物质对Hela细胞增殖的影响
50μmol/L的柚皮苷和诺米林处理HeLa细胞24 h后能明显抑制HeLa细胞增殖，细胞抑制率分别为（8.05±1.25）%和（4.16±1.35）%；同时，可观察到处理组培养液中均出现漂浮的死细胞。而柠檬苦素对HeLa细胞抑制率较小，仅为（2.13±0.84）%。
3 种苦味物质对Hela细胞凋亡的影响
结果显示，经过柠檬苦素处理HeLa细胞24 h后，与对照组相比，Bax基因表达量极显着增加（P＜0.01），Bcl-2基因表达量显着增加（P＜0.05）；HeLa细胞经过柚皮苷处理24 h后Bax基因表达量较对照组极显着增加（P＜0.01）；HeLa细胞经过柚皮苷、柠檬苦素和诺米林处理24 h后TNFR1基因表达量较对照组有明显的增长趋势，而Casepase-8基因表达量较对照组无明显变化。此外，经这3 种物质处理HeLa细胞24 h后，Caspase-9、Caspase-3、Fas、Cytochrome c基因表达量与对照组相比均无显着变化。
3 种苦味物质对Hela细胞迁移的影响
图2 、3细胞划痕实验结果显示了3 种苦味物质对HeLa细胞迁移的抑制和相对迁移率的影响。诺米林处理HeLa细胞24 h和48 h后，HeLa细胞相对迁移率极显着降低（P＜0.01），表明诺米林显着降低了HeLa细胞的迁移能力（图2中50 μmol/L诺米林处理24、48 h和图3C）。柠檬苦素处理HeLa细胞24 h后，对照组迁移距离较实验组远（图2中50 μmol/L柠檬苦素处理24 h），HeLa细胞相对迁移率极显着降低（P＜0.01），但48 h后HeLa细胞迁移能力较对照组没有显着差异（图3A），可能是培养基中有血清导致结果受到增殖的影响。柚皮苷处理HeLa细胞24 h和48 h后，HeLa细胞相对迁移率极显着降低（P＜0.01）（图2中50 μmol/L柚皮苷处理24、48 h和图3B），因此，柚皮苷显着降低了HeLa细胞的迁移能力。
讨 论
本研究以高台蜜柚种子和白色海绵层为原料，分别进行柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的提取、分离纯化和检测。柠檬苦素类似物和柚皮苷的提取率分别为5.21 mg/g和7.72 mg/g，柠檬苦素、诺米林和柚皮苷的纯度分别为94.08%、93.91%和93.39%。
柠檬苦素、诺米林和柚皮苷均选择50 μmol/L工作浓度，通过体外培养HeLa细胞，研究其对HeLa细胞增殖、凋亡和迁移能力的影响，以不同方式探讨3 种苦味物质对HeLa细胞的作用机制：柚皮苷和柠檬苦素均能显着促进HeLa细胞凋亡，柚皮苷和诺米林均能抑制HeLa细胞增殖，3 种苦味物质均能显着抑制HeLa细胞迁移。
本研究通过CCK-8实验证明了3 种苦味物质对宫颈癌细胞增殖的影响，柚皮苷和诺米林作用24 h后能明显抑制HeLa细胞增殖，而柠檬苦素抑制作用较弱，不同的柠檬苦素类似物对同一癌细胞的作用效果是有较大差异的。为探究3 种苦味物质抑制癌症的作用机制，本研究利用实时定量PCR实验，对Bcl-2、Bax、Caspase-9、Caspase-8、Caspase-3、TNFR1、Fas、Cytochrome c基因表达量进行了检测。柠檬苦素作用于HeLa细胞24 h后基因Bcl-2、Bax表达量极显着增加（P＜0.01），柚皮苷作用于HeLa细胞后基因Bcl-2表达量极显着增加（P＜0.01），证明柚皮苷有可能通过内源性途径抑制细胞凋亡。同时，死亡受体基因TNFR1表达量有明显上升趋势，可能是其外源性凋亡途径也发挥了作用；Caspase-8表达量无明显变化，因此TNFR1不是通过激活Caspase-8而调控外源性凋亡途径的，而有可能通过激活TNK/AP-1途径达到外源促凋亡作用。在研究过程中发现经过3 种苦味物质处理后，HeLa细胞的迁移速率可能变慢，为了证明猜测，进行了细胞划痕实验。细胞迁移实验结果证实3种苦味物质均能极显着抑制癌细胞转移。本研究中还发现苦味物质作用后癌细胞贴壁较弱，形态发生较大变化，活性降低，这也是细胞迁移能力显着减弱的具体体现。
通过本研究发现，柑橘及其制品中3 种苦味物质柠檬苦素、诺米林和柚皮苷对宫颈癌HeLa细胞具有明显的抑制增殖和促凋亡作用，能够作为一种潜在的抑制癌症的药物原材料进行开发和研究，实验结果可为今后的相关探索提供一定的数据支持。
