南京农业大学食品科技学院的郭建平、万佳佳、别小妹*等人利用实验室筛选出的金黄色葡萄球菌特异性靶点基因SAR0395建立一种可视化LAMP检测方法,该可视化LAMP不需要昂贵的设备且操作简单,可以在设备较落后的地区进行金黄色葡萄球菌的快速检测,同时该可视化LAMP可以结合酶标仪进行金黄色葡萄球菌的高通量检测。
1、LAMP反应的建立与优化
通过LAMP反应的优化,可以得到最优的LAMP添加体系为:外侧引物(F3和B3)各0.2 μmol/L,内侧引物(FIP和BIP)各1.6 μmol/L,dNTPs终浓度1 mmol/L,Mg2+终浓度4.0 mmol/L,1×ThermoPol buffer(20 mmol/L Tris-HCl,50 mmol/L KCl,10 mmol/L (NH4)2SO4,2 mmol/L MgSO4,0.1% TritonX-20,pH 8.8,25 ℃), Bst 2.0 WarmStart?DNA聚合酶终浓度0.4 U/μL,1 μL DNA模板,加水补足20 μL。20 μL灭菌石蜡油进行液封。反应条件:60 ℃、保温1 h。
2、可视化LAMP检测方法的建立
实验结果说明在LAMP反应体系中添加120 μmol/L的HNB,可以建立一种可视化LAMP;可视化LAMP在60 ℃反应1 h,空白对照的颜色和阳性反应的颜色可以用肉眼清楚辨别。
3、不同引物添加体系分析
LAMP反应20 min后,引物添加体系IV(B3+F3+FIP+BIP+LB+LF)会发生颜色变化,反应管变为天蓝色;V(B3+F3+FIP+BIP+LF)、VI(B3+FIP+BIP+LB+LF)的颜色会在LAMP反应30 min后变为天蓝色;I(B3+FIP+BIP)、III(B3+FIP+BIP+LF)的颜色会在LAMP反应40 min后变为天蓝色;II(B3+F3+FIP+BIP)的颜色会在LAMP反应60 min后变为天蓝色,空白对照颜色一直为紫色。实验中引物添加体系IV(B3+F3+FIP+BIP+LB+LF)会在反应20 min后,发生颜色的变化,是最优的引物添加体系,本研究中选择LAMP反应的引物添加体系为IV(B3+F3+FIP+BIP+LB+LF)。
4、可视化LAMP的灵敏度
可视化LAMP反应30 min以后,其基因组灵敏度可以达到1.03 pg/μL,其菌落灵敏度可以达到1.9×104 CFU/mL。这一灵敏度和文献中报道的灵敏度有一定差距,将LAMP反应时间设置为60 min。可视化LAMP反应60 min以后,其基因组灵敏度可以达到0.010 3 fg/μL,其菌落灵敏度可以达到1.9 CFU/mL。
5、可视化LAMP的特异性
可视化LAMP反应60 min以后,可以发现46 株金黄色葡萄球菌的反应液颜色变为天蓝色,LAMP反应结果为阳性;24 株非金黄色葡萄球菌反应液颜色未变化仍然为紫色,LAMP反应结果为阴性;通过特异性实验可以证实该可视化LAMP检测方法具有良好的特异性。
讨 论
本研究建立一种针对金黄色葡萄球菌的可视化LAMP检测方法,并验证了其特异性与灵敏度。通过添加HNB、石蜡油和Bst 2.0 WarmStart DNA聚合酶等手段可以有效控制假阳性。本研究中建立的可视化LAMP具有快速、直观、高灵敏度、高特异性的特点,该可视化LAMP将会成为食品中金黄色葡萄球菌快速检测的重要手段,为金黄色葡萄球菌的检测与控制做出重要贡献。