福建农林大学食品科学学院的黄 翔、陶 蕾、杨 燃、黄 群*等人选取乳酸产量相对较高的蒙氏肠球菌、保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌4 种乳酸菌复合发酵蛋壳生物制备乳酸钙，利用响应面法对发酵工艺进行优化，以提高转化效益与乳酸钙产量，为后续乳酸菌发酵法回收利用废弃蛋壳制备乳酸钙提供实验基础和理论依据。
1、拮抗实验结果
平板上4 种菌均生长良好，两两交叉处无菌落萎缩或消失现象，说明4 种菌之间没有拮抗作用，可以用于混菌复合发酵实验。
2、乳酸菌生长曲线
4 种乳酸菌的延滞期较短，在接种后0～4?h开始缓慢生长，该时期内细胞繁殖较慢，数量增长较少。菌体经过较短的延迟期后进入对数生长期，在4～10?h内生长迅速，呈指数级增长，菌种代谢和繁殖加快，酶系活跃，代谢旺盛，培养基内菌株生长速率达到最大。到12?h时总菌数达到较高水平并基本保持不变，进入稳定期，菌体生长速率变化幅度趋于平稳，活菌数保持相对稳定。
3、复合菌株组合对乳酸钙产量的影响
复合菌种接种量比为1∶1∶2∶1时，乳酸钙产量最高。对结果进行的差异显着性分析表明，接种比为1∶1∶2∶1与1∶2∶2∶1、2∶1∶1∶1无显着差异（P＞0.05），与其他12 组均有显着差异。有研究报道，嗜热链球菌及保加利亚乳杆菌以1∶1接种的发酵活力最佳。
4、单因素试验结果
随着发酵温度的升高，乳酸钙产量先升高后下降，发酵温度对乳酸钙产量影响显着。37 ℃时乳酸钙产量达最大值，残糖量最低，说明复合乳酸菌利用葡萄糖的效果最好。当培养温度低于37 ℃时，温度过低，酶活性受抑制，酶促反应减弱，导致菌体生长和代谢减缓。故高于37 ℃后乳酸钙产量降低。复合乳酸菌的适宜发酵温度为37 ℃。
随着发酵时间的延长，乳酸钙产量逐渐升高，葡萄糖含量逐渐降低。发酵时间对乳酸钙产量和残糖量有显着影响。当发酵时间超过60?h后，乳酸钙产量增长缓慢且趋于停止。发酵时间以60～72?h为宜。
随着培养基初始pH值的升高，乳酸钙产量呈现先升高后降低的变化特征。初始pH值对乳酸钙产量有显着影响。当pH值较低时，由于大量氢离子的存在，超过了乳酸菌保持胞内pH值动态平衡的能力，导致膜脂饱和度下降，胞内pH值也随之下降，从而抑制了乳酸菌的生长。发酵培养基pH值以6.0为宜。
随着接种量的增加，乳酸钙产量逐渐降低。这是因为接种量过多时，菌体生长过快，微生物对营养物质的竞争增强，培养液黏度增加，加速细胞衰老，导致部分菌体死亡，并且产生过多代谢废物，葡萄糖利用降低，发酵后劲不足，从而影响代谢产物的合成，产酸量随之下降。发酵接种量以8.0%为宜。
5、响应面试验结果
响应面回归模型的建立与分析
拟合方程的P值小于0.000 1，表明响应回归模型达到了极显着水平。失拟项P=0.051 0＞0.05，失拟不显着，说明方程的拟合程度较好，回归方程可以准确分析和预测各因素与乳酸钙产量之间的关系。模型的确定系数R2为0.988 3，说明该模型能解释98.83%响应值的变化，因而该模型拟合程度较好，能很好地反映响应值的变化，可以利用此模型对乳酸钙产量进行分析和预测。
响应面分析与优化
分析可知，发酵液pH值（B）和接种量（C）的交互作用对乳酸钙产量的影响最为明显。初始pH值对乳酸钙产量影响的等高线较密集，说明发酵液初始pH值的影响更为显着，与模型方差分析得出的结论一致。
最佳条件的预测及验证
通过回归模型的预测，响应值（Y）最大值时各因子水平为A=1、B=1、C=－1。对应的复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙最佳工艺条件为发酵温度37 ℃、发酵时间72?h、发酵液pH?6.5、复合菌接种量8.0%，在此条件下预测乳酸钙产量为42.030?g/L。
结 论
利用鸡蛋壳为天然绿色钙源通过生物发酵转化制备乳酸钙，采用复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙，单因素试验研究了发酵温度、初始pH值、接种量等因素对乳酸钙产量的影响；在此基础上根据Box-Behnken试验设计和响应面分析对发酵条件进行优化。结果表明，复合乳酸菌发酵蛋壳制备乳酸钙的最佳工艺条件为：发酵温度37 ℃、发酵时间72?h、初始pH?6.5、复合菌接种量8.0%，在此条件下，乳酸钙产量达（40.01±0.035）g/L，纯度为92.65%。通过傅里叶变换红外光谱、X-射线衍射表征了乳酸钙的结构，证实发酵得到的产物即为乳酸钙。此研究为进一步利用微生物发酵蛋壳制备乳酸钙的开发利用提供了理论依据，且为鸡蛋壳的综合利用开辟了可行、有效途径。
