河南农业大学食品科学技术学院，东北农业大学 乳品科学教育部重点实验室的王小鹏、赵新淮*利用TGase催化制备壳寡糖糖基化酪蛋白，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳（SDS-PAGE）、反相-高效液相色谱（RP-HPLC）证实糖基化修饰反应的发生；以水解度（DH）和三氯乙酸可溶性氮（TCA-SN）为指标分析糖基化修饰对蛋白质体外消化能力的影响；葡聚糖凝胶过滤色谱分析消化物中肽组分分子质量分布情况，以期科学评价TGase途径糖基化修饰对蛋白质消化性的影响，为新型蛋白质配料的开发提供理论依据。
1、酪蛋白糖基化的SDS-PAGE验证
与酪蛋白（泳道1）相比，糖基化酪蛋白（泳道2）的α、β亚基谱带明显减少，而在分离胶顶端有明显的新谱带出现，表明有大分子的蛋白质共聚物生成。在分离胶顶端出现大分子蛋白质聚合物的位置，出现了新条带，该条带具有明显的糖染色现象，表明糖基化酪蛋白中含有糖基。
2、氨基葡萄糖的导入量
氨基葡萄糖的标准曲线
利用RP-HPLC测定不同质量浓度氨基葡萄糖溶液对应的峰面积，可发现氨基葡萄糖质量浓度（x）与所测峰面积（y）呈线性关系，方程为：y=999 904x－59 368（R2 =0.999 3）。线性关系良好，可以用于计算糖基化酪蛋白中氨基葡萄糖的导入量。
TGase途径糖基化酪蛋白中
氨基葡萄糖的导入量
氨基葡萄糖标准品在4.6 min左右处出现峰1。壳寡糖糖基化酪蛋白的水解物也在4.6 min时出现了峰1，表明在该水解物中存在和氨基葡萄糖标准品水解物相同的组分，即糖基化酪蛋白中有氨基葡萄糖的存在。
3、糖基化修饰反应对酪蛋白的体外消化性的影响
胃蛋白酶水解
随着水解时间的延长，糖基化酪蛋白和酪蛋白的水解程度逐渐上升，糖基化酪蛋白的胃蛋白酶消化能力低于酪蛋白。经胃蛋白酶水解60 min后，酪蛋白和糖基化酪蛋白的TCA-SN分别提高了6.73%和6.22%；当以DH为评价指标时，酪蛋白和糖基化酪蛋白的DH分别增加2.02%和1.93%。
胰蛋白酶进一步水解
两种水解物的DH随时间的延长持续增加，反应前15 min DH增加较快，随后反应速度放缓。经胰蛋白酶水解后，酪蛋白胃蛋白酶消化物的TCA-SN从6.73%增加到41.88%，糖基化酪蛋白胃蛋白酶消化物的TCA-SN从6.22%增加到38.74%；以DH为评价指标，在120 min的水解时间内，酪蛋白胃蛋白酶消化物的DH从2.02%增加到14.57%，糖基化酪蛋白胃蛋白酶消化物的DH从1.93%增加到13.76%。
4、糖基化酪蛋白消化物的肽分子质量分布
糖基化酪蛋白消化物含有较多的大分子物质（≥612.6 Da）。TGase对蛋白质进行糖基化修饰的同时，也催化蛋白质发生分子内和分子间交联反应，生成大分子的聚合物，以及糖与蛋白质的交联产物。交联反应改变了蛋白质的结构，影响了消化酶的识别位点，修饰产物的消化性降低，体外模拟消化后形成了较大分子质量的肽段。
结 论
本实验通过SDS-PAGE和RP-HPLC分析，证实TGase能够催化酪蛋白和壳寡糖发生糖基化交联修饰反应，修饰产物为糖基化酪蛋白；体外模拟消化结果表明，糖基化修饰反应对酪蛋白的消化性产生了一定不利影响；糖基化酪蛋白水解物中更多大分子质量肽段的存在，进一步证实了糖基化修饰反应对酪蛋白消化性的抑制作用。本研究可为TGase途径蛋白质糖基化修饰技术的工业化应用提供理论支持和技术参考。
