为克服上述缺点，本实验选择构建一种平均粒径在50～500 nm的水包油（O/W）纳米乳液载运体系，以期改善叶黄素的溶解性、稳定性和生物活性。纳米乳液是一种理想的活性成分载运体系。近年来，出现了许多利用乳液体系包埋叶黄素的报道，主要研究乳化剂类型、贮存温度和pH值等因素对乳液理化稳定性的影响。
因为叶黄素是一种天然抗氧化剂，且其稳定性和生理活性易受环境因素（如食品基质和加工处理条件）的影响；因此，上海交通大学农业与生物学院的李季楠、胡浩和吴艳*等人主要以自由基清除活性评价为目的，首先构建一种叶黄素纳米乳液体系，并评价其对1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）自由基和2,2’-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)（ABTS）阳离子自由基的清除能力和氧自由基吸收能力（ORAC），进一步分析常见环境因素（pH值、热处理、离子强度和浓缩）对乳液体系的叶黄素质量浓度以及自由基清除活性的影响，以分析纳米乳液载运体系在多种条件下的叶黄素载运有效性。
叶黄素纳米乳液基本性质和抗氧化活性
叶黄素纳米乳液的平均粒径、多分散系数（PDI）和Zeta电位分别为（223.77±2.40）nm、0.119±0.018和（-40.22±1.39）mV；叶黄素纳米乳液的平均粒径小于250 nm，PDI小于0.2，表明其粒径分布较窄；乳滴携带的净电位值大于30 mV，表明乳滴之间的静电斥力足以维持乳液体系的物理稳定。
叶黄素纳米乳液体系的DPPH、ABTS阳离子自由基清除率和ORAC分别为（26.91±2.45）%、（48.63±2.31）%和（48.69±2.25）μmol/mL，显着大于空白纳米乳液（不含叶黄素）和叶黄素油水混合物（未经高压均质的粗乳液）以及叶黄素有机溶剂体系（溶剂为DMSO）（P＜0.05），表明纳米乳液体系能够显着改善叶黄素的抗氧化活性。
环境因素对叶黄素纳米乳液稳定性和抗氧化活性的影响
pH值对叶黄素纳米乳液稳定性和抗氧化活性的影响
图1 pH值对叶黄素纳米乳液稳定性和抗氧化活性的影响
pH 2.0～12.0范围内叶黄素纳米乳液中叶黄素质量浓度的变化如图1A所示。因酪蛋白酸钠的等电点为pH 4.6，故调节乳液pH值为4.0左右时，静电斥力不足以维持体系的稳定，乳液很快分层失稳，因此未能对其中的叶黄素质量浓度进行测定；当调节乳液pH值为2.0后，与原乳液相比，其中的叶黄素质量浓度有所减小（下降了9.30%），其余各pH值条件下纳米乳液中的叶黄素质量浓度均无显着变化（P＜0.05）。以上结果表明酸性条件下叶黄素分子容易发生降解，故该纳米乳液产品应尽量避免在酸性食品中应用。
由图1B可知，pH 2.0时的叶黄素纳米乳液DPPH自由基清除能力显着大于原乳液，pH 6.0～10.0范围内DPPH自由基清除率差异并不显着（P＞0.05），当pH值至12.0时，DPPH自由基清除能力显着小于原乳液（P＜0.05）。
由图1B可知，在pH 2.0、6.0、8.0、10.0和12.0时叶黄素纳米乳液的ABTS阳离子自由基清除率分别为（12.93±0.42）%、（48.54±1.19）%、（48.23±3.59）%、（50.99±3.60）%和（55.94±1.81）%，pH 6.0～8.0范围内ABTS阳离子自由基清除率与原乳液无显着差异（P＞0.05），当pH值为2.0时，叶黄素纳米乳液的ABTS阳离子自由基清除能力显着减小（P＜0.05）。当pH值增加至10.0～12.0时，乳液的ABTS阳离子自由基清除能力有所增加。
在pH 2.0、6.0、8.0、10.0和12.0时叶黄素纳米乳液ORAC分别为（18.03±1.82）、（46.97±1.99）、（44.22±2.49）、（50.80±1.63）、（47.53±2.79）μmol/mL（图1B），叶黄素纳米乳液在酸性条件下的ORAC显着减小（P＜0.05），其他pH值下并无显着性差异（P＞0.05），可能是酸性条件下叶黄素发生部分降解所致。
综上所述，不同评价方法结果表明强酸及强碱条件对叶黄素纳米乳液的抗氧化活性有不同程度的影响，故该乳液产品应尽量在中性条件下贮存和应用。
热处理对叶黄素纳米乳液稳定性和抗氧化活性的影响
类胡萝卜素分子内含有多个共轭双键，对热处理较为敏感，与原乳液相比，60～100 ℃下水浴30 min后，叶黄素纳米乳液中的叶黄素质量浓度并未发生显着变化（P＞0.05），仅在100 ℃热处理后，乳液中的叶黄素降解量较大（8.35%）。如图2B所示，60、80 ℃和100 ℃水浴30 min后，叶黄素纳米乳液的DPPH自由基清除能力显着减小（P＜0.05），ABTS阳离子自由基清除能力与原乳液相比无显着性差异（P＞0.05）。对于ORAC来说，仅在100 ℃热处理之后显着减小（P＜0.05）。3 种评价方法均表明低温短时热处理对乳液自由基清除活力的影响相对较小。
离子强度对叶黄素纳米乳液稳定性和抗氧化活性的影响
因前期实验（数据未发表）表明NaCl浓度大于100 mmol/L时，乳液在贮存期间容易失稳，故选择调节离子强度为50 mmol/L和100 mmol/L。纳米乳液体系内叶黄素质量浓度未发生显着变化（P＞0.05）。
加NaCl溶液调节乳液的离子强度为50 mmol/L和100 mmol/L后，除ORAC外，其DPPH自由基清除率和ABTS阳离子自由基清除率均显着小于原乳液（P＜0.05），但不同离子强度之间两种自由基清除率不存在显着差异（P＞0.05）。
浓缩对叶黄素纳米乳液稳定性和抗氧化活性的影响
利用旋转蒸发设备将新制叶黄素纳米乳液分别浓缩至原体积的4/5、3/5、2/5和1/5，随着浓缩程度的增加，乳液体系内的水分被大量移除，故相同体积内叶黄素质量浓度显着大于未经浓缩处理的原乳液（P＜0.05），而浓缩至4/5和3/5时的乳液中叶黄素质量浓度并无显着差异（P＞0.05）。
随着浓缩程度的增加，叶黄素纳米乳液的自由基清除能力均显着增大（P＜0.05）。浓缩至原乳液体积的4/5、3/5之后，乳液体系自由基清除率相近，此时体系内的叶黄素质量浓度无显着差异，因此推测自由基清除能力与体系内的叶黄素质量浓度具有一定的相关性。
叶黄素纳米乳液的FTIR分析
冻干叶黄素纳米乳液样品与叶黄素标准品粉末的FTIR谱图如下图所示。叶黄素纳米乳液样品未发生吸收峰位移和产生新的吸收峰。
结 论
结果表明，该纳米乳液体系显着改善了叶黄素的自由基清除活性和ORAC；pH值（6.0～12.0）、离子强度（50、100 mmol/L NaCl）和热处理对体系中叶黄素稳定性的影响均不显着，仅当pH值为2.0及100 ℃热处理后叶黄素的降解量相对较大，且此时自由基清除活性及ORAC有不同程度的减小；而浓缩处理后纳米乳液体系的叶黄素质量浓度和抗氧化活性均显着增大；加入NaCl溶液后乳液的抗氧化活性则有所减小。综上，在食品工业中，应尽量避免将该叶黄素纳米乳液应用在高温、偏酸性和较高的离子强度条件下，以免造成叶黄素生理活性的损失，同时需进一步研究如何改善纳米乳液在生产加工过程中的稳定性。
