曲霉表达系统具有蛋白分泌量高、成本低、可进行蛋白翻译后修饰等优点，黑曲霉作为典型的丝状真菌，被广泛地用于重组蛋白的表达。此外，黑曲霉作为Generally recognized as safe（GRAS）微生物被广泛用作食品行业酶制剂的生产菌株。
华南理工大学生物科学与工程学院的何玉兰、王斌和潘力*使用黑曲霉自身强启动子（PglaA）实现酸性果胶裂解酶基因pelD的过量表达，通过融合6×His标签实现重组果胶裂解酶的纯化，研究了重组果胶裂解酶的酶学性质，并测定了其对3 种不同果汁（橙汁、苹果汁和葡萄汁）的澄清效果，以期为酸性果胶裂解酶的工业化应用提供支持。
01
酸性果胶裂解酶基因克隆及序列分析
以黑曲霉CBS513.88菌株基因组DNA为模板，PCR扩增得到酸性果胶裂解酶基因（pelD）序列。酸性果胶裂解酶基因pelD全长为1 369 bp，编码373 个氨基酸，经SignalP4.1在线预测分析，表明该蛋白具有N-端信号肽，信号肽切割位点在第19～20个氨基酸之间。
02
重组酸性果胶裂解酶的表达
将pelD基因用infusion酶连接到表达载体，获得重组表达质粒pMD18-pelD，重组表达质粒示意图如图1所示，使用黑曲霉自身强启动子（葡萄糖淀粉酶启动子PglaA）实现酸性果胶裂解酶基因pelD的过量表达。
酸性果胶裂解酶活力随培养时间的延长而增加，在120 h时达到最高（8 822.6 U/mL）。同时，作为阴性对照的宿主菌未检测到酸性果胶裂解酶活力。对发酵上清液进行SDS-PAGE检测，结果表明在大约40 kDa的位置出现一条明显的电泳条带，与预测的理论分子质量大小（39.0 kDa）一致，说明重组酸性果胶裂解酶在黑曲霉SH-2中成功实现了过量表达。
03
重组酸性果胶裂解酶的纯化
为更好地研究重组酸性果胶裂解酶的性质，对带有组氨酸标签的重组蛋白进行镍柱亲和层析纯化。经一步纯化后得到了单一条带（图3A）。经镍柱一步纯化后，重组酸性果胶裂解酶纯化倍数为4.9 倍，回收率为79.4%，比活力达到8 522.7 U/mg。此外，通过Western blot进一步验证了重组蛋白（图3B）。
04
重组酸性果胶裂解酶酶学性质分析
重组酸性果胶裂解酶的底物特异性
以底物为柑橘果胶的酶活力为100%，计算其他底物的相对酶活力。重组酸性果胶裂解酶对柑橘果胶的酶活力最高为31 248.0 U/mL，其次为苹果果胶（11 164.1 U/mL），而对聚半乳糖醛酸钠盐仅有微弱的酶活力。表明重组酸性果胶裂解酶能够特异性降解高酯化程度的果胶。
最适反应pH值及pH值稳定性
将重组酸性果胶裂解酶置于不同pH值（3.0～7.0）缓冲液中测定酶活力，结果表明该重组酶最适反应pH值为5.0，当pH值大于7时，酶活力基本为0。将重组酸性果胶裂解酶置于不同pH值（3.0～7.0）缓冲液中，40 ℃保温2 h后测定残余酶活力，结果表明该重组酶在酸性条件下稳定性良好，在pH 3.0～6.5范围内能保持50%以上的相对酶活力。
最适反应温度及热稳定性
将重组酶置于不同温度（20～80 ℃）下测定酶活力，结果表明该重组酶的最适反应温度为50 ℃。将重组酸性果胶裂解酶置于不同温度（30～70 ℃）保温2 h后测定残余酶活力，结果表明该重组酶在30～50 ℃范围内稳定性较好，能保持80%以上的相对酶活力。
金属离子及化学试剂对重组酶的影响
结果表明，在1 mmol/L浓度下，Ca2+、Mg2+、Cu2+、Zn2+、Ni2+、Mn2+、Ba2+对该重组酶具有不同程度的激活作用，其中Zn2+、Ni2+、Ba2+激活作用较为显着；而表明活性剂SDS对重组酶有明显的抑制作用，其他金属离子对重组酶活力无明显影响。
05
重组酸性果胶裂解酶在果汁澄清中的应用
结果表明，经重组酸性果胶裂解酶处理后，橙汁、苹果汁以及葡萄汁在660 nm波长处的透光度显着高于对照组，说明重组酸性果胶裂解酶对3 种果汁有显着的澄清效果。其中橙汁的透光度从1.7%增加到30.5%，提高了16.9倍；而苹果汁的透光度从6.7%增加至77.0%，提高了10.5 倍；葡萄汁的透光度从13.9%增加至79.2%，提高了4.7 倍。此外，使橙汁、苹果汁以及葡萄汁达到较好的澄清效果的加酶量分别为10、5、1 U/mL。
讨 论
本研究利用黑曲霉自身强启动子PglaA实现了黑曲霉酸性果胶裂解酶基因pelD的过量表达，使得酸性果胶裂解酶活力在摇瓶培养120 h达到8 822.6 U/mL，显着高于之前文献报道，为该重组酶的大规模工业化生产提供了理论支持。
此外，以黑曲霉为蛋白表达宿主在纯化方面存在一定的困难，本实验经一步亲和层析得到了高纯度目的蛋白，回收率为79.4%，比活力达到8 522.7 U/mg。对重组酶的底物特异性研究表明，重组酸性果胶裂解酶可特异性降解高度甲酯化果胶。重组酸性果胶裂解酶对橙汁、苹果汁和葡萄汁均表现出良好的澄清作用，且酶的添加量较少。综上所述，该重组酶在果蔬汁加工业中具有较大的应用潜力。
