福州大学生物科学与工程学院的廖 兰、文晓艳、倪 莉*等人以与麦醇溶蛋白降敏程度显着相关的产酸速率、酸化性能和蛋白质水解度为依据，筛选出具有相似表现的两株乳酸菌——植物乳杆菌B02012和消化乳杆菌20998制备长时发酵面团，其中植物乳杆菌B02012由本实验室前期紫外诱变获得，具有高产酸和耐消化的特点，可作为一种乳酸菌制剂广泛应用于微生态制剂中。同时，以可食性有机酸脱酰胺降敏小麦蛋白制备的发酵面团（化学酸化面团）和传统酵母菌长时发酵面团为对照，探究两株乳杆菌长时发酵对酸面团麦醇溶蛋白二、三级分子结构和免疫特性的影响及其相关性，以期初步筛选出可应用于开发低敏面食品的优势乳酸菌。
1、植物乳杆菌B02012和消化乳杆菌20998的生长曲线和pH值变化曲线
植物乳杆菌B02012和消化乳杆菌20998两株菌的生长曲线和pH值变化趋势相似。0～2 h为乳酸菌生长延滞期，此时乳酸菌正在复苏；4～15 h为对数生长期，乳酸菌呈指数型生长，大量繁殖；15～24 h为稳定期，由于营养物质不足，乳酸菌的生长和死亡处于动态平衡。因此，两株乳杆菌用于酸面团发酵的最佳收获时间为20 h左右。
2、发酵过程中面团pH值变化
添加植物乳杆菌B02012和消化乳杆菌20998面团的pH值变化趋势接近，SLB02012、SYLB02012、SL20998和SYL20998组面团的pH值随着发酵的进行开始迅速降低，发酵9 h后趋于平缓。此外，SLB02012、SL20998组面团的pH值最终至3.0，发酵6 h后始终低于SYLB02012和SYL20998组。CK和SCA组面团pH值在发酵过程中变化较小。面团SY的pH值在发酵前期缓慢降低，稳定在pH 5左右，当发酵16 h后pH值由5快速降低至约3.5。以上结果说明，乳酸菌在面团发酵期间对pH值的变化起到主导作用，相对于酵母菌产酸速率更快。
3、全蛋白的SDS-PAGE变化
2 种乳杆菌发酵面团的蛋白质条带较其他组变化显着。SL20998和SYL20998组面团，分子质量在66.2 kDa以上的条带几乎完全解离，而50 kDa左右的低分子质量亚基条带和35 kDa处的条带保持较好。植物乳杆菌B02012降解蛋白质能力大于消化乳杆菌20998，因此SLB02012、SYLB02012组面团在50 kDa左右及低分子质量麦醇溶蛋白的条带变淡，且SLB02012中的蛋白质条带相比SYLB02012更淡，这可能是因为乳酸菌产生的酸性环境在一定程度上抑制了酵母菌的生长，酵母菌同其竞争营养物质也影响了乳酸菌的生长。
4、麦醇溶蛋白的FTIR分析结果
经长时发酵处理后，蛋白质分子的很多特征吸收峰都发生了偏移。CK的—OH伸缩振动特征吸收峰为3 421.15 cm－1，而SY、SCA、SLB02012、SYLB02012、SL20998、SYL20998特征峰发生偏移，SLB02012和SYLB02012移动范围分别为109 cm－1和112 cm－1，说明植物乳酸杆菌B02012对蛋白质中—OH影响显着，这可能是其发酵过程中对氢键的作用所导致。SLB02012的—CH伸缩振动特征吸收峰从2 924.47 cm－1偏移到2 929.15 cm－1。与SL20998相比，SCA、SLB02012在酰胺I带振动强度较大，表明可食性有机酸酸化和植物乳酸杆菌B02012发酵面团中麦醇溶蛋白分子的构象发生了变化，相比消化乳酸杆菌20998更能促进麦醇溶蛋白结构中的酰胺I带伸缩振动。
5、麦醇溶蛋白的IFS分析结果
SL20998的λmax发生红移（从342 nm到343 nm），可能是因为在天然蛋白质中，色氨酸一般处于分子内部，被非极性氨基酸包围，经消化乳杆菌20998长时发酵后，蛋白质三级结构展开，聚集程度降低，处于分子内部的色氨酸逐渐暴露出来；因此，荧光强度增加，λmax发生红移。相对于CK，SY、SLB02012和SYLB02012的λmax发生了蓝移（从342 nm分别到341、341、340 nm），表明植物乳杆菌B02012发酵的面团中麦醇溶蛋白发生三级结构聚集，色氨酸暴露程度减少。
6、麦醇溶蛋白的ELISA分析结果
SCA、SY、SLB02012、SYLB02012组面团经过24 h发酵后麦醇溶蛋白免疫反应性相对于CK组呈下降趋势，SLB02012中麦醇溶蛋白的免疫反应性降低了35%，下降最显着，该降敏程度高于可食性有机酸酸化发酵面团和传统酵母菌发酵面团。而SL20998和SYL20998组面团中麦醇溶蛋白免疫反应性非但没有降低反而增强，分别增加了30%和14%。由IFS分析可知，SCA、SLB02012和SYLB02012的λmax发生蓝移，蛋白质聚集，抗原表位被覆盖，暴露程度小，被抗体识别的可能性小，从而使得免疫反应性降低。由SDS-PAGE分析可知，SLB02012组面团中的HMW-GS、中分子质量蛋白及麦醇溶蛋白条带较其他各组面团的蛋白质水解程度更大，这可能使得原本可以被抗体识别的免疫表位由于蛋白发生了更大程度的水解，随机去除抗原活性位点或增加了活性位点空间位阻，抗原暴露量减少，免疫反应性降低。
7、层次聚类分析结果
7 个样品分为3 类：第1类样品是加入了消化乳杆菌20998发酵的面团（SL20998、SYL20988），免疫反应性增强大于23%；第2类样品为SY和SYLB02012，免疫反应性下降约14%；第3类样品为SCA和SLB02012，免疫反应性降低约30%。该结果说明，相同聚类的样品免疫反应性变化表现出相似性，且本研究中植物乳杆菌B02012发酵面团表现出和可食性有机酸酸化面团相近的降敏效果。
结 论
植物乳杆菌B02012是本实验室经紫外诱变后用于微生态制剂的乳酸菌，在酸面团长时发酵过程中对蛋白质进行降解，产生的小分子肽段、氨基酸和乳酸等物质可以丰富面团风味，而且表现出较好的降低免疫反应性的效果。植物乳杆菌B02012可作为优势菌用于开发低敏食品，对于构建低敏长时发酵酸面团工业化生产体系有着重要的实际意义。
