北京工商大学食品与健康学院、北京食品营养与人类健康高精尖创新中心、食品添加剂与配料北京高校工程研究中心的丛艳君、吕晓哲、李晔等人所在课题组前期系统研究了牛乳主要过敏原αS1-酪蛋白的作用表位及关键氨基酸，在本实验中，重点研究了牛乳αS1-酪蛋白与大豆蛋白中的致敏蛋白是否存在交叉过敏反应。以牛乳过敏婴幼儿血清、αS1-酪蛋白单克隆抗体为探针，通过免疫印迹实验识别鉴定大豆蛋白质交叉过敏原，并通过生物信息学软件进行序列比对，验证体外实验结果，最后深入探究了交叉过敏原的消化稳定性和热稳定性。
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牛乳过敏患者血清识别交叉过敏原
图1显示，牛乳过敏患者混合血清与αS1-酪蛋白发生了特异性反应，说明患者血清中含有αS1-酪蛋白特异性IgE。牛乳过敏患者混合血清与大豆中的β-伴大豆球蛋白α亚基（Gly m Bd 60K）和11S碱性链发生了免疫反应。为排除假阳性反应，用小鼠阴性血清进行了免疫印迹实验，结果显示，阴性小鼠血清与αS1-酪蛋白、α-酪蛋白没有发生反应，与大豆分离蛋白反应了一个条带，分子质量为21 kDa的11S碱性链。即牛乳过敏患者血清识别大豆蛋白的交叉过敏原为β-伴大豆球蛋白α亚基（Gly m Bd 60K）。
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牛乳αS1-酪蛋白单克隆抗体识别交叉过敏原
经鉴定αS1-酪蛋白单克隆抗体的亚型为IgG1，效价为1∶320 000。αS1-酪蛋白、α-酪蛋白、大豆分离蛋白与αS1-酪蛋白抗体均发生了免疫反应，与大豆分离蛋白反应结果显示出2 个条带，测定其分子质量分别为68、21 kDa，即为β-伴大豆球蛋白α亚基（Gly m Bd 60K）和11S碱性链。为排除假阳性反应，用小鼠阴性血清进行了免疫印迹抑制实验，结果显示，小鼠阴性血清与αS1-酪蛋白、α-酪蛋白没有发生反应，与大豆分离蛋白反应了1 个条带，分子质量为21 kDa，即为大豆11S碱性链。因此大豆β-伴大豆球蛋白α亚基与αS1-酪蛋白抗体发生了特异性免疫反应，为交叉过敏原。
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牛乳αS1-酪蛋白与大豆Gly m Bd 60K的氨基酸序列比对
αS1-酪蛋白在GenBank的登录号为AAA30429.1，Gly m Bd 60K的登录号为BAA23360.2，应用DNAStar软件导出各蛋白的氨基酸序列。用BLASTp工具分析两种蛋白质的序列相似性为39%，两种蛋白的相似氨基酸序列如下表所示。
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交叉过敏原的消化稳定性
大豆胰蛋白酶抑制剂到60 min仍未被胃蛋白酶消化，推测其具有很强的抗消化性；鸡蛋清白蛋白在30 min时条带完全消化；αS1-酪蛋白在2 min时条带完全消化；马铃薯酸性磷酸酶经过胃蛋白酶消化15 s时条带消失。交叉过敏原Gly m Bd 60K在15 s条带颜色虽然变浅，但仍清晰可见，2 min时条带消失，推测Gly m Bd 60K在模拟胃液中的消化时间为2 min。根据SDS-PAGE结果，消化稳定性由强到弱为大豆胰蛋白酶抑制剂＞鸡蛋清白蛋白＞αS1-酪蛋白= Gly m Bd 60K＞马铃薯酸性磷酸酶，大豆交叉过敏原Gly m Bd 60K的消化稳定性比较好。
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加热对过敏原交叉反应性的影响
在70、100 ℃加热不同时间，Gly m Bd 60K与αS1-酪蛋白单克隆抗体发生了特异性免疫反应，阴性血清结果有效排除了假阳性反应，即加热没有影响Gly m Bd 60K与αS1-酪蛋白抗体的交叉反应性。
讨 论
本研究通过生物信息学工具和软件预测αS1-酪蛋白和Gly m Bd 60K蛋白序列相似性为39%，并找到两组相似氨基酸序列，两种蛋白可能会发生交叉过敏反应。
在国内外研究的基础上，本研究以中国牛乳过敏婴幼儿血清为探针，通过免疫印迹方法识别鉴定大豆蛋白的交叉过敏原为β-伴大豆球蛋白α亚基，即Gly m Bd 60K蛋白，体外模拟胃液消化实验表明α亚基具有较强的抗消化性，热处理不会影响牛乳αS1-酪蛋白单克隆抗体与α亚基的免疫反应特性。目前，对于导致不同食物间交叉过敏的免疫病理学的详细机制尚不完全清楚，由于过敏原之间的交叉过敏受到越来越多的关注，对交叉过敏反应的机理研究也成为当务之急。
