小龙虾，学名克氏原鳌虾（Procambarus clarkii），作为一种重要的经济虾类，广泛分布在我国长江中下游地区。其肉质肥美、鲜嫩，倍受消费者青睐，现已逐步形成了集“苗种繁育、健康养殖、加工出口、餐饮物流、节庆文化”于一体的产业链。与其他水产品类似，在运输、贮藏过程中，极易受微生物活动、化学氧化和酶反应3 种破坏机制的影响，致其品质快速劣变。
浙江大学生物系统工程与食品科学学院，馥莉食品研究院，智能食品加工技术与装备国家（地方）联合实验室，农业部农产品产后处理重点实验室，农业部农产品营养功能评价实验室，浙江省农产品加工技术研究重点实验室的江杨阳、胡亚芹*和浙江大学舟山海洋研究中心的杨水兵等人应用高通量测序法分别鉴定冷藏小龙虾的鲜样、腐败中期样及腐败末期样所对应的优势菌群，并将其腐败末期鉴定结果与培养基鉴定法进行比较，验证高通量测序法精准、高效性的同时，准确分析小龙虾物流贮运加工过程中的优势腐败菌，旨在为冷藏小龙虾的腐败机理解析及其保鲜研究提供重要的参考依据。
1、冷藏期间小龙虾TVB-N值及TVC值变化
贮藏初期，数值增长较为平缓，而当达到30 mg/100 g的安全限值时，增长显着增加。小龙虾TVB-N初始值为5.6 mg/100 g，贮藏第2天数值为18.76 mg/100 g，而贮藏第8天后，其数值已达到45.36 mg/100 g，伴随较为强烈的氨臭味，可知已达到小龙虾的货架期终点。
菌落总数随贮藏时间的延长而增加，并在第6天达到6.82（lg（CFU/g）），超过无公害水产品安全限值所规定的6.0（lg（CFU/g）），表示已到达小龙虾的货架期。相比TVB-N值，菌落总数预示的货架期终点稍早，可能是由于细菌的增长主导TVB-N的产生，故其增长滞后于菌落总数的增长。
2、培养基鉴定法
优势腐败菌的分离
虾肉样品通过稀释涂布平板和平板划线法，根据菌落的形态、颜色差异，在TSA、BP、CFC、MRS、VRBGA、孟加拉红6 种培养基上，分别分离出4、2、2、1、2、0共11 株菌株。编号依次为T1、T2、T3、T4、B1、B2、C1、C2、M、V1、V2。
优势腐败菌的腐败特性
实验组的TVB-N值均高于对照组，且在第6天时，绝大部分实验组的TVB-N值已超出30 mg/100 g，而对照组在第9天时，其TVB-N值仍未到达这一限值。贮藏至第12天时，对照组的TVB-N值为39.39 mg/100 g，而实验组T2组最大，为82.41 mg/100 g，V2组最低，为50.45 mg/100 g。故确定这11 株菌株均为小龙虾的优势腐败菌。
优势腐败菌的分子鉴定
结合致腐能力分析，可知气单胞菌、微球菌属、粪肠球菌属、微小杆菌属、希瓦氏菌属致腐能力最强，巨型球菌属和弗氏柠檬酸杆菌致腐能力较弱。
3、高通量测序法鉴定优势腐败菌
PCR扩增结果及微生物数量分析
3 个不同时期共有的微生物共有102 种。鲜样期与腐败中期共有微生物121 种，低于腐败中期与末期共有的413 种。说明腐败中期与腐败末期的物种相似度很高，产生差异的OTU丰度较低。
物种多样性分析
3 个时期有效序列范围为17 034～29 324 条。在相似水平97%上对其进行聚类分析（OTU），得到鲜样的OTU数为452，腐败中期OTU数为434，腐败末期OTU数为327。表明随着贮藏时间延长，小龙虾的微生物种类呈现降低趋势。此外，与鲜样组比较，虾肉中期及末期组的Shannon、Simpson、Chao1指数均减小，说明虾肉样品中微生物物种多样性和丰富度均下降。其中，Simpson指数变化较小，这是由于该数值主要综合体现物种的丰富度和均匀度，但不只是考虑种类数目的变化，还考虑了种类之间的配比变化。数值变化不大，则说明尽管物种种类数目有一定变化，但整体各物种间的相对比例变化不明显。由此可以验证特定腐败菌的生长繁殖抑制其他微生物菌群生长结论的正确性。
菌相组成分析
腐败末期样品占据主要地位的菌属依次为希瓦氏菌、肉食杆菌、环丝菌属、嗜冷菌属、漫游球菌属、不动杆菌属，六者之和物种丰度占据90.57%。与鲜样菌属比较，除不动杆菌属由初期的4.76%下降至2.19%，其他5 种比列均上升。希瓦氏菌由10.04%升至63.19%，肉食杆菌、环丝菌属均由0.02%分别升至7.33%、6.48%，嗜冷菌属和漫游球菌属则分别由1.91%、0.20%升至6.32%和2.93%。
结论与讨论
本实验利用传统培养基法和高通量测序法分析测定冷藏小龙虾菌属变化情况，传统法提取的11 株菌株基本全包含在高通量法测序结果菌株中，可以验证高通量法的高效、精准性。传统法共分离11 株菌株，并对这些菌株进行致腐能力测定，结果表明气单胞菌致腐能力最强，弗氏柠檬酸杆菌致腐能力最弱。高通量法则分别比较小龙虾鲜样期、腐败中期及腐败末期菌属变化，发现随着贮藏时间延长，菌属多样性下降但某些菌属的丰度呈现上升趋势，尤其在腐败末期时，希瓦氏菌、肉食杆菌、环丝菌属、嗜冷菌属、漫游球菌属、不动杆菌属6 种菌属共占据物种丰度的90.57%，证实特定腐败菌的生长繁殖会抑制其他微生物菌群生长，并可以确定小龙虾的优势腐败菌为希瓦氏菌、肉食杆菌、环丝菌属、嗜冷菌属、漫游球菌属、不动杆菌属、气单胞菌、束毛球菌属等。
