色谱长度与分离度通常成正比。色谱柱越长，组分之间分辩效果越好，但色谱柱越长压降越大，而输入的压力是有限的。色谱柱过长会增大进出口压力比，相反会降低分离度。通常采用的柱长2m~4m，内径2mm，毛细管柱长度可达20m～150m，内径为0.2mm。
2、色谱柱填料颗粒大小
填料的粒子越细，由于表面积增加，分辩效果越好，分离度就越高。但是颗粒极细时可能会增大柱压降，也会起反作用。一般采用惰性、多孔的固体颗粒。多由硅藻土或玻璃珠制成，分析不同极性的微生物化合物，为了获得最适的分离条件，要求有不同固定相的载体。
3、柱温
气体在液体中的溶解度或在固体表面的吸附程度都随温度增高而降低，在气液色谱分析中，当超过一定温度时，静态的液体通常会从色谱柱中挥发掉，所以选择柱温时应考虑到样品的沸点。一般是略低于样品沸点的平均值。
4、载气种类
常用的载气有 氮气、氢气等。其中氢气、氦气的分子量较小，有利于提高分析速度，但浓度较高的介质易在其间形成扩散，影响分离度，所以在实际测量中氢气、氦气一般都用在介质浓度较低的区域并提高其流速，减少扩散的影响。
5、载气流速
介质在固定相上的滞留时间，主要取决于介质自身的特性(挥发性，极性等)和载气的流速。所以流速快慢直接影响分离度。
