来自中国计量大学生命科学学院的王佩佩、戴贤君和浙江省农业科学院农产品质量标准研究所的杨华、肖英平*基于16S rRNA V3～V4的Illumina高通量测序方法，分析家禽屠宰场不同区域水体、地面和屠宰器械表面微生物结构特征，并从中分离大肠杆菌，通过VITEK2进行耐药性评估，应用聚合酶链式反应（PCR）技术检测磺胺类、喹诺酮类和四环素类基因等9大类耐药基因，为全面、准确地认识家禽屠宰场环境微生物多样性、耐药基因传播扩散与环境风险间的关系提供科学依据。
1. 样品微生物物种丰富度及多样性
在门水平上，屠宰区域水体、地面和屠宰器械表面微生物主要分属于9 个门，其中变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）的相对丰度分别为45.18%～87.74%、0.09%～33.46%、3.34%～28.09%，三者共同构成了屠宰场区域水体、地面和屠宰器械表面细菌菌群的主要结构。
2. 屠宰区域水体、地面和屠宰器械表面细菌菌群结构
属水平上，优势菌属为不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）、水栖菌属（Enhydrobacter）、皮生球菌属（Dermacoccus） 、假单胞菌属（Pseudomonas）、黄杆菌属（Flavobacterium）、乳球菌属（Tetragenococcus）、金黄杆菌属（Chryseobacterium）和弓形杆菌属（Arcobacter）。其中不动杆菌属（Acinetobacter）在屠宰区域水体、地面和屠宰器械表面的相对丰度分别为16.18%～19.88%、7.86%～38.64%、5.66%～41.62%。
3. 样品的聚类与PCoA分析
根据各样品OTU的种类及其丰度，计算样品间的加权UniFrac距离，对18 个屠宰区域水体与屠宰器械表面微生物样品进行了PCoA分析。结果表明，同种样品如屠宰区域水体微生物之间、屠宰场地面和屠宰器械表面微生物之间显示出明显聚集，而屠宰区域水体跟屠宰场地面和屠宰器械表面微生物之间相距较远，与图3的菌群丰度热图结果类似。
4. 屠宰区域水体、地面和屠宰器械表面微生物样品的耐药基因检测结果
通过对18 个屠宰区域水体、地面和屠宰器械表面微生物样品中的9大类抗生素24 种耐药基因的PCR扩增发现，21 种耐药基因分布在这些样品中。由此可见屠宰场微生物的耐药基因检出率很高，其中sulI、sulII、qnrS、blaTEM和aadA1的检出率为100%，floR、tetA和ereA的检出率为88.9%以上。
5. 大肠杆菌的耐药表型和耐药基因检测情况
通过对分离获得的17 株大肠杆菌的耐药表型进行分类整理。结果显示大肠杆菌对17 种抗生素产生了不同的耐药性，对氨苄西林耐药率最高（64.71%），其次为复方新诺明、头孢唑啉、头孢曲松，耐药率分别为35.29%、29.41%、29.41%，对哌拉西林、厄他培南、替加环素、硝基呋喃均不敏感。从耐药菌株数来看，大肠杆菌耐8、9 种和10 种药物各一株，另外同时耐氨苄西林和复方新诺明2 种药物的大肠杆菌菌株比例较大，约占17.65%，耐3 种及以上抗生素的大肠杆菌菌株占35.28%。多重耐药指一种微生物对3 类（如磺胺类、青霉素类、喹诺酮类）或3 类及以上抗生素同时耐药，而不是对同一类3 种抗生素耐药。分离的17 株大肠杆菌中，多重耐药菌株为7 株，占41.18%，最多耐5 种类型的抗生素，分别为单环β-内酰胺类、头孢菌素类、氨基糖苷类、碳青霉烯类和磺胺类，同时耐4 类抗生素类型的菌株最多，数目为3 株（17.65%），其中同时耐2 类抗生素的有3 株（17.65%），同时耐3 种类型抗生素的有2 株（11.76%）。
通过对17 株大肠杆菌的9大类9 种耐药基因的PCR扩增发现，6 种耐药基因分布在这些菌株中，由此可见屠宰场大肠杆菌的耐药基因耐药率很高。大肠杆菌对blaTEM和pmrA的耐药基因耐药率最高，均达到了75%，其次为qnrS、floR、aadA1、sulI，耐药率分别为70.59%、58.82%、58.82%、23.53%，对ermB、mecC、tetB无检出。与屠宰场不同区域水体、地面和器械表面微生物的耐药基因PCR检测结果相比较，说明屠宰场不同区域水体、地面和器械表面微生物的耐药基因主要来自于样品中的大肠杆菌。
6. 屠宰场水体、地面和器械来源大肠杆菌分离株的ERIC-PCR分型
屠宰场水体、地面和器械来源分离的大肠杆菌在相似系数0.80的水平上，可分为I～V 5 种菌型。其中ECCNJD145可能是由于采样的原因或者是实验操作的原因单独呈一个亲缘关系较远的基因型，可忽略不计。处于一楼的宰杀沥血间地表水分离的大肠杆菌，与位于二楼的包装间地表水分离的大肠杆菌具有相同的ERIC-PCR菌型，表明两者属于同一克隆体，大肠杆菌可以沿冷鲜鸡屠宰链进行克隆传播。因此在屠宰过程中，处于较低的地表水极有可能在屠宰过程中飞溅从而污染到悬挂着的肉鸡。
结 论
屠宰场不同区域水体、地面和屠宰器械表面微生物均以变形菌门（Proteobacteria）、厚壁菌门（Firmicutes）和放线菌门（Actinobacteria）为主；优势菌属为不动杆菌属（Acinetobacter）、链球菌属（Streptococcus）、嗜冷杆菌属（Psychrobacter）和假单胞菌属（Pseudomonas）等一些腐败菌属与致病菌属。屠宰场不同区域的水体、地面和屠宰器械表面存在的耐药基因种类较多，共检测到21 种耐药基因分布在这些样品中，其中sulI、sulII、blaTEM、aadA1、floR、tetA、ereA和qnrS等8 种耐药基因检出率达88.9%以上，与从中分离的大肠杆菌耐药基因检出情况吻合度较低，这表明还存在其他携带耐药基因的菌株，此外分离的大肠杆菌菌株多重耐药现象严重。ERIC-PCR分型结果表明，大肠杆菌可以沿屠宰生产链进行克隆传播。本实验将为探究屠宰环境微生物与鸡肉污染微生物之间的关系提供理论参考。
